细胞与分子免疫学-2研究生免疫球蛋白.ppt

《细胞与分子免疫学-2研究生免疫球蛋白.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞与分子免疫学-2研究生免疫球蛋白.ppt（42页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、免疫球蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白编码基因免疫球蛋白编码基因基因工程抗体基因工程抗体南京医科大学南京医科大学微生物学与免疫学系微生物学与免疫学系卢卢春春 概述概述1、免疫球蛋白、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)：1968和和1972年年WHO和国际免疫学会决定，将具有抗体活性和国际免疫学会决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白称为免疫球蛋白。或化学结构与抗体相似的球蛋白称为免疫球蛋白。2、抗体、抗体(antibody,Ab)：B淋巴细胞在有效的淋巴细胞在有效的抗原刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生抗原刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白

2、，这类免疫球蛋白称为抗体。特异性结合的免疫球蛋白，这类免疫球蛋白称为抗体。3、Ig与与Ab的区别和联系：的区别和联系：Ig是化学结构上的是化学结构上的概念；概念；Ab是生物学功能上的概念；所有的是生物学功能上的概念；所有的Ab都属于都属于Ig；并非所有的；并非所有的Ig都具有都具有Ab的活性。的活性。免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白的基本结构1、Ig的组成：的组成：由由4条肽链通过链间条肽链通过链间S-S双硫键连接双硫键连接而成，其中两条分子量较大的链称重链（而成，其中两条分子量较大的链称重链（Heavychain，H链），两条分子量较小链的称轻链（链），两条分子量较小链的称轻链（Lightch

3、ain，L链）。链）。2、H链：链：据氨基酸（据氨基酸（aa）组成及序列的差异（抗原）组成及序列的差异（抗原性）将性）将H链分为链分为5类，类，、链；链；其分别对应于，其分别对应于，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM五类五类Ig。第一节第一节免疫球蛋白的结构和功能免疫球蛋白的结构和功能 CH1VLCLVHCH2CH3HingeRegionCarbohydrateDisulfidebondImmunoglobulin Structure3、L链：链：据据aa组成及序列的差异将组成及序列的差异将L链分为链分为2型，型，、型，型，：为为2：1（人）。（人）。天然天然Ig单体中，两条单体中，两条重

4、链是同类的，重链是同类的，两条两条轻链是同型的。轻链是同型的。4、Ig的分区：的分区：（1 1）可变区：）可变区：）可变区：）可变区：在在Ig近近N端端L链的链的1/2和和H链的链的1/4（、）或）或1/5（、）范围内，因）范围内，因aa组成及序列变化较大，组成及序列变化较大，故称故称可变区（可变区（Variableregion，V区）。区）。（2 2）恒定区：）恒定区：）恒定区：）恒定区：在在Ig近近C端端L链的链的1/2和和H链的链的3/4（、）或）或4/5（、）范围内，因）范围内，因aa组成及序列变化相对稳组成及序列变化相对稳定故称定故称恒定区（恒定区（Constantregion，C区

5、）。区）。CH1VLCLVHCH2CH3HingeRegionCarbohydrateDisulfidebondImmunoglobulin Structure5、Ig的结构域又称功能区的结构域又称功能区(Domain)：（1 1）VHVH、VLVL：超变区超变区（HVR1、2、3）、互补性决定区、互补性决定区（CDR1、CDR2、CDR3），又称，又称Ig独特型决定簇独特型决定簇（Idiotype）;（2 2）CH1CH1、CLCL：是各类、亚类、型、亚型是各类、亚类、型、亚型Ig遗传标记遗传标记所在部位所在部位;（3 3）IgGIgG的的的的CH2CH2：补体补体C1q的结合位点；的结合位

6、点；IgG借助借助CH2通过胎盘，发挥被动免疫作用；通过胎盘，发挥被动免疫作用；（4 4）CH3CH3：IgG的的CH3与中性粒、巨噬细胞表面表达的与中性粒、巨噬细胞表面表达的Fc R结合，完成免疫调理作用；结合，完成免疫调理作用；与与NK细胞细胞表面表达的表面表达的Fc RIII结合，完成结合，完成ADCC作用；作用；（5 5）IgEIgE的的的的CH4CH4：IgE的的CH4与肥大和嗜碱性粒细胞表与肥大和嗜碱性粒细胞表面表达的面表达的Fc R结合，完成结合，完成I型超敏反型超敏反应；应；（6 6）绞）绞）绞）绞链区（链区（链区（链区（HingeregionHingeregion）：）：）：

7、）：TY CH1VLCLVHCH2CH3HingeRegionCarbohydrateDisulfidebondImmunoglobulin StructureFab（Fragment of antigen-binding）Ag bindingValence=1Specificity determined by VH and VLPapainFcFabFc（Crystalizable fragment）Effector functions6、Ig的水解片段的水解片段(木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶)F(ab)2Ag bindingValence=2pFcNo effector functionsPeps

8、inpFcPeptidesF(ab)26、Ig的水解片段的水解片段(胃蛋白酶胃蛋白酶)7、Ig的其他成分的其他成分（1 1）J J链链链链：（：（：（：（joiningchainjoiningchain）由浆细胞合成，功能是将由浆细胞合成，功能是将单体单体Ig分子连接为多聚体。如分子连接为多聚体。如2个个IgA单体形单体形成二聚体；成二聚体；5个个IgM单体是形成五聚体。单体是形成五聚体。7、Ig的其他成分的其他成分（2 2）分泌片）分泌片）分泌片）分泌片：（：（：（：（secretorypiece,SPsecretorypiece,SP）由黏膜上皮细胞由黏膜上皮细胞合成和分泌，功能是保护分泌

9、型合成和分泌，功能是保护分泌型IgA或或的的IgM铰链区免受蛋白酶的降解。铰链区免受蛋白酶的降解。五类五类IgIg的特点的特点 Ig Ig的生物学活性的生物学活性1、特异性结合抗原、特异性结合抗原2、激活补体、激活补体3、与细胞、与细胞Fc受体结合发挥生物效应受体结合发挥生物效应（1）免疫调理作用）免疫调理作用（2）ADCC（3）介导）介导I型超敏反应型超敏反应（4）人）人IgG的的Fc段与段与SPA结合结合4、选择性传递、选择性传递Ab的生物学活性的生物学活性第二节第二节免疫球蛋白编码基因和抗体的多样性免疫球蛋白编码基因和抗体的多样性 概述人类人类B淋巴细胞存在三个编码淋巴细胞存在三个编码I

10、g的基因库，的基因库，即重链即重链H基因库及基因库及轻链轻链、基因库，它们分别基因库，它们分别位位于第于第14、2及及22号染色体上。号染色体上。一、胚系一、胚系B细胞中细胞中Ig轻链基因的结构轻链基因的结构由由3个基因所编码：个基因所编码：V基因、基因、J基因编码可变基因编码可变区；区；C基因编码恒定区，即基因编码恒定区，即V-J-C。（一）（一）链基因结构链基因结构1 1、V V：V基因节段有基因节段有90个，呈簇状串联排列个，呈簇状串联排列（V1Vn，n=90），其中含），其中含30个假基因（指无功能个假基因（指无功能性表达或只表达无功能产物的缺陷基因，但它可通过突性表达或只表达无功能产

11、物的缺陷基因，但它可通过突变、置换及重排形成新的功能性基因，为可变区的多样变、置换及重排形成新的功能性基因，为可变区的多样性提供后备基因）。性提供后备基因）。V编码编码V区区110aa中的中的196aa；2 2、L L序列：序列：每个每个V前都有一个前都有一个L序列（序列（Leader），编），编码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；3 3、JJ：位于位于VV下游，也呈串联排列，含下游，也呈串联排列，含5 5个基因节个基因节段，编码段，编码V V区区110aa110aa中的中的9797110aa110aa；4 4、C C：只含单个外显子，编码只含单个外

12、显子，编码C C区蛋白。区蛋白。（二）（二）链基因结构链基因结构1 1、VV：V基因节段有基因节段有60个，呈簇状串联排列（个，呈簇状串联排列（V1Vn，n=60），其中含），其中含30个假基因个假基因；2 2、L L序序列列：每每个个V前前都都有有一一个个L序序列列（Leader），编编码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；码产物为前导肽，对轻链蛋白合成至关重要；3、J1C1，J2C2J7C7：C1C7代表各个亚型代表各个亚型链的基因节段，其中含链的基因节段，其中含4个个功能基因节段和功能基因节段和3个假基因。个假基因。二、胚系二、胚系B细胞中细胞中Ig重链基因的结构重链基因的结构由四个基

13、因所编码：由四个基因所编码：V基因、基因、D基因、基因、J基因基因编码可变区；编码可变区；C基因编码恒定区，即基因编码恒定区，即V-D-J-C。（一）（一）重链重链V区基因区基因1、VH：VH基因节段有基因节段有95个，成簇状串联排列个，成簇状串联排列（VH1VHn，n=95），其中含），其中含45个假基因。每个个假基因。每个VH前都有一个前都有一个L序列（序列（Leader），其作用是在合成重链时），其作用是在合成重链时将重链固定在粗面内质网膜上。将重链固定在粗面内质网膜上。LnVHn编码疏水前导编码疏水前导肽和肽和CDR1及及CDR2；C DH(1-23)2、DH，JH：DH有有23个节段

14、，成簇状串联排列；个节段，成簇状串联排列；JH有有9个节段，其中个节段，其中6个功能基因和个功能基因和3个伪基因。个伪基因。DHJH编编码码CDR3，JH编码可变区的骨架部分（编码可变区的骨架部分（Frameworkregion）。）。C DH(1-23)（二）（二）重链重链C区基因区基因1、CH：CH基因节段在染色体上的排列顺序与其编码基因节段在染色体上的排列顺序与其编码的的Ig在体内成熟的顺序相似，分别是在体内成熟的顺序相似，分别是CC C3C1C1C2C4CC2。除。除C 以外，其他以外，其他CH基因节段都有一个转换区（基因节段都有一个转换区（Switchregion，S区），区），其作

15、用是控制其作用是控制Ig类型转换；类型转换；C DH(1-23)2、控制膜结合或分泌型、控制膜结合或分泌型Ig的基因：的基因：每个每个CH基因基因节段后分别排列着节段后分别排列着S和和M两基因，两基因，S即分泌型，即分泌型，M即膜即膜结合型，如结合型，如CSM、C S M。C DH(1-23)三、三、B细胞分化过程中的基因重排细胞分化过程中的基因重排1、基因重排定义：、基因重排定义：在在B细胞分化和发育过程中，细胞分化和发育过程中，一部分基因节段互相接近、重新排列，形成功能一部分基因节段互相接近、重新排列，形成功能性的免疫球蛋白基因单位，此过程称性的免疫球蛋白基因单位，此过程称基因重排基因重排

16、（GeneRearrangement）。功能性的免疫球蛋）。功能性的免疫球蛋白基因单位进行转录，经转录后的加工，再表达白基因单位进行转录，经转录后的加工，再表达为免疫球蛋白。为免疫球蛋白。2、可变区的基因重排：、可变区的基因重排：（1）重链可变区的基因重排：）重链可变区的基因重排：选择一个选择一个DH与一与一个个JH节段连接（节段连接（DHJH），再选择一个），再选择一个VH与与DHJH相连，一旦相连，一旦VHDHJH重排成功且得到功能性重排成功且得到功能性表达，其产物就会抑制另一条染色体上等位基因重排，表达，其产物就会抑制另一条染色体上等位基因重排，此现象称为等位基因排除。其产物同时启动轻链

17、可变此现象称为等位基因排除。其产物同时启动轻链可变区的基因重排；区的基因重排；C DH(1-23)（2）轻链可变区的基因重排：）轻链可变区的基因重排：链基因优于链基因优于链基链基因重排。选择一个因重排。选择一个V与一个与一个J节段连接节段连接VJ，其，其产物就会发生等位基因排除，同时也会抑制产物就会发生等位基因排除，同时也会抑制链基因重链基因重排，称为同型排除。当两条染色体上的排，称为同型排除。当两条染色体上的链基因重排链基因重排都失败时，才会启动都失败时，才会启动链基因重排。两条染色体上的链基因重排。两条染色体上的VH基因都是无产物重排，或基因都是无产物重排，或基因和基因和基因都是无产基因都

18、是无产物重排，细胞凋亡（物重排，细胞凋亡（Apoptosis）。）。（3 3）可变区的基因重排可变区的基因重排12122323规律和重组酶的规律和重组酶的作用：作用：可变区的基因重排受基因节段侧面的重组信号序列可变区的基因重排受基因节段侧面的重组信号序列（RSS）控制，遵循）控制，遵循1223规律且与规律且与DNA损伤修复系统有关。损伤修复系统有关。（4 4）重链类型转换）重链类型转换：每个每个CH（C除外）前都含一除外）前都含一个个S区（短的串联重复序列），区（短的串联重复序列），S区与重链类型转换有关。区与重链类型转换有关。在在B细胞分化过程中细胞分化过程中，V-D-J的重排及其与的重排及

19、其与C的连接是不的连接是不依赖抗原刺激，重排的依赖抗原刺激，重排的V-D-J与与C和和C连接，经转录加连接，经转录加工，此时在工，此时在B细胞表面表达细胞表面表达mIgM和和/或或mIgD。成熟的成熟的B细胞在抗原刺激下细胞在抗原刺激下，B细胞在分泌细胞在分泌IgM和和/或或IgD的同时，的同时，V-D-J从与从与C基因连接转换到与基因连接转换到与C或或C或或C的连接，完成了类型转换。的连接，完成了类型转换。C DH(1-23)2、Ig的多样性：的多样性：（1）组合性连接：组合性连接：重链的重链的V-D-J连接（连接（95个个V基因、基因、23个个D基因，基因，9个个J基因）；轻链的基因）；轻

20、链的V-J-C（90个个V基基因、因、5个个J基因、一个基因、一个C基因；基因；60个个V基因、基因、7个个J基因和基因和C基因）；基因）；（2）接合多样性：接合多样性：发生在发生在D-J、V-D-J、V-J连接连接时，时，1密码子错位；密码子错位；2框架（框架（ORF）移位；）移位；3N-序列序列插入；插入；（3）体细胞突变：体细胞突变：体细胞突变也可以产生体细胞突变也可以产生Ig的多的多样性。样性。3、重排过程第三节第三节基因工程抗体基因工程抗体（GeneticEngineeringAntibody）概述单克隆抗体单克隆抗体(McAb)在临床疾病诊断和治疗中在临床疾病诊断和治疗中已发挥了很

21、大的作用，但以下几点限制了抗体的已发挥了很大的作用，但以下几点限制了抗体的导向治疗：导向治疗：（1）鼠源性）鼠源性McAb在人体内易诱导免疫应答；在人体内易诱导免疫应答；（2）人的）人的McAb制备甚为困难。制备甚为困难。一、嵌合抗体一、嵌合抗体（ChimericAntibody）原理：原理：保留鼠保留鼠IgIg可变区部分，将其恒定区用人可变区部分，将其恒定区用人IgIg取代。取代。方法：方法：PCR克隆克隆鼠鼠可变区基因和可变区基因和人人恒定区基因，恒定区基因，将两将两 基因连接，并插入原核或真核表达载体中，并基因连接，并插入原核或真核表达载体中，并 导入大肠杆菌或转染真核细胞，就可表达出嵌

22、导入大肠杆菌或转染真核细胞，就可表达出嵌 合抗体分子。合抗体分子。优点：优点：亲和力保持良好。亲和力保持良好。缺点：缺点：含鼠含鼠IgIg可变区的异源性，仍可变区的异源性，仍易诱导人免疫应答易诱导人免疫应答。原理：原理：仅保留鼠仅保留鼠IgIg可变区可变区CDR部分，将部分，将IgIg其它区域都其它区域都 用人用人IgIg取代。取代。方法：方法：CDR序列的获得通常采用序列的获得通常采用PCR技术。技术。优点：优点：大大降低了鼠抗体的免疫原性。大大降低了鼠抗体的免疫原性。缺点：缺点：亲和力不佳。亲和力不佳。二、二、CDR移植抗体移植抗体（CDRGraftingAntibodyCDRGrafti

23、ngAntibody）又称重构抗体或改形抗体（又称重构抗体或改形抗体（ReshapedAntibody）原理：原理：将鼠将鼠IgFv中的中的VH和和VL两肽链用不同的连接物两肽链用不同的连接物连接成一条多肽链，称为单链抗体（连接成一条多肽链，称为单链抗体（ScFv）；）；将两个相同或不同特异性的将两个相同或不同特异性的ScFv连接在一个分连接在一个分子上，就获得了双价子上，就获得了双价ScFv。方法：方法：DNA重组技术；共价或非共价交连。重组技术；共价或非共价交连。优点：优点：亲和力保持良好，可针对亲和力保持良好，可针对2 2个不同的抗原表位。个不同的抗原表位。缺点：缺点：容易解离或被组织酶

24、解。容易解离或被组织酶解。三、三、单链抗体（单链抗体（ScFv）和）和双价双价ScFv原理：原理：将鼠将鼠IgFab基因片段与丝状噬菌体基因片段与丝状噬菌体FUSE5载体连接，产载体连接，产物转化大肠杆菌，使物转化大肠杆菌，使Fab与噬菌体外壳蛋白基因与噬菌体外壳蛋白基因III以融以融合蛋白表达的形式表达在丝状噬菌体表面，构建成噬菌合蛋白表达的形式表达在丝状噬菌体表面，构建成噬菌体表面肽库（体表面肽库（Phagepeptidelibrarydisplay）；再用特）；再用特异性抗原对该肽库进行筛选，获得具有高度抗原亲和力异性抗原对该肽库进行筛选，获得具有高度抗原亲和力的的Fab，最后进行体外重建。，最后进行体外重建。方法：方法：DNA重组技术；重组技术；ELISA。优点：优点：亲和力保持良好。亲和力保持良好。缺点：缺点：容易解离或被组织酶解。容易解离或被组织酶解。四、噬菌体肽库技术构建抗体片段四、噬菌体肽库技术构建抗体片段Thanks!