4章 影响生物修复的环境条件(1).ppt





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1、第四章第四章 影响生物修复的环境条件影响生物修复的环境条件 第一节 环境条件与微生物降解第二节 微生物系统的人工调控第三节 土壤理化性状第四节 地下水特征第五节 大气特征第六节 现场调查与评价第七节 可处理性研究第一节 环境条件与微生物降解一、非生物因子对微生物降解的影响二、生物因子对微生物降解的影响物理、化学和生物等环境条件都会影响微生物的生存和活动,即影响微生物的种类、生物化学转化速率和生物降解产物。如不同地点取样的微生物对同一个污染物代谢情况有很大差异。一、非生物因子对微生物降解的影响物理化学因子矿质元素供应多种基质作用一、非生物因子对微生物降解的影响1、物理化学因子包括:温度,pH,土
2、壤水分,盐分,水压(深海和深层土壤)每种微生物对环境都有一个耐受范围。超过了范围,降解作用就不会发生。(1)温度 一般是随温度增加而增加(2)pH 一般用石灰调节酸性土壤(3)水分 土壤水分是重要限制因子。最适宜的水分是田间持水量田间持水量的30-90%。最适水分取决于土壤特性,化合物种类已厌氧还是好氧转化。含油污泥的生物降解的最适水分为田间持水量的30-90%。(4)盐分 设计渗透压(5)压力 海底高压力不适应微生物降解。调节上述因子有利于提高效率,但是往往在经济上是不可行的,也不具有可操作性。不过,在反应器中,或者在可控环境中调节温度、水分、pH值可使生物降解反应达到最佳。2、养分供应(1
3、)碳源碳源对细菌和真菌的生长很重要。碳源对细菌和真菌的生长很重要。有机物污染物在环境界面上的有机碳浓度很高,一般不会成为限制因子,但N、P含量很低,而K,S,Mg,Ca,Fe等通常不缺。这是这是N、P经经常成为限制因子,需要添加的原因。常成为限制因子,需要添加的原因。由于共代谢等多种原因,向环境基质中加入有机物或单一化合物往往会促进污染物的降解。见下表通常,在土壤中加入联苯可以加速PCBs 的矿化。间甲酚BHCDDTDDT,七氯2,6-二氯苯胺马拉硫磷(2)氮和磷一般,微生物要求C:N20:1;C:P50-100:1无论是海水,还是土壤中,加入氮磷肥料是促进石油类污染物降解的有力措施。肥料开发
4、:亲油性肥料(oleophilic fertilizers)辛基磷酸盐,癸基磷酸盐,石蜡化尿素,十二烷基尿素。通常是同时加入多种养分(NP)促进作用会更大些。添加N和P对底土中菲矿化的影响在在DEHP存在条件下,存在条件下,无无NP时,菲根本就时,菲根本就不矿化分解不矿化分解(3)生长因子(营养物质:维生素、氨基酸等)1.原养型(prototrophs)2.营养缺陷型(auxotrophs):指不能制造某种生长因子海水和土壤中90%的细菌,沉积物中75-80%的细菌是营养缺陷型;细菌、真菌和藻类可以分泌生长因子,高级生物可以排泄生长因子.(4)氧气供应 原油和烃类的降解需要充足的氧气。氧气是仅
5、有的或优先电子受体。在深水、土壤和地下水中由于氧气的限制,常常导致降解很慢或不能进行。典型的修复策略是增加供氧,如强制供气,添加过氧化氢等(5)多种基质作用在自然条件或污染条件下,污染物通常是多基质的。微生物在多种基质存在下的降解行为是有很大差别的。多种机制作用的现象p其一、多种有机质可以同时被利用其一、多种有机质可以同时被利用解释:可能是微生物各自有不同的基质 p其二、一种基质可以促进另一种基质的利用其二、一种基质可以促进另一种基质的利用F解释:添加一种基质促进了微生物的生长,从而导致对另一种基质的利用;一种基质是共代谢物,因此,添加后,促进另一种降解;添加某种化合物,诱导微生物产生分解酶;
6、两种化合物中有一种浓度很低,低于生长阈值,另一种化合物可以提供能源,从而促进衡量物质的降解。p其三、一种基质可以减缓另一种基质的利用其三、一种基质可以减缓另一种基质的利用F解释:一种化合物毒性很高,抑制微生物生长而造成另一种化合物降解变缓一种化合物的产物不利于第二种微生物群体的生长由于某种降解微生物的增加,对营养竞争的结果导致另一微生物生长受到抑制p其四、基质可以被顺序利用其四、基质可以被顺序利用二、生物因子对微生物降解的影响协同作用捕食作用p1 协同作用协同作用例子:许多生物降解需要多种微生物的合作。单一菌株不能降解,而混合菌株能降解。如节杆菌属(Arthrobacter)和琏霉菌属(Str
7、eptomyces)在一起时才能矿化二嗪磷。协同机制(1)提供生长因子(2)分解不完全降解物(3)分解共代谢产物(4)分解有毒物:第一种微生物产生的产物对自身有害,而第二种微生物则能降解该产物.p 2 捕食捕食环境中有大量的捕食、寄生微生物,通常对于生物修复是有害的,某些情况下也可以是有益的.原生动物:有抑制和促进两种作用.捕食速率低,细菌繁殖迅速情况下,不会产生很大影响;反之,影响显著.如原生动物对高浓度细胞的4-硝基苯的矿化不会产生影响,在低浓度时,矿化速率明显变慢.p捕食在某些情况下也可促进降解.原生动物也可分泌生长因子促进降解.如原生动物在土壤、海洋等环境中捕食、消化细菌后可分泌维生素
8、、氨基酸等生长因子,促进营养缺陷型菌的生长.第二节 微生物系统的人工调控一、微生物的驯化二、菌株接种三、基因工程菌一、微生物的驯化1 驯化期的概念:污染物开始不发生降解或降解很慢,经过一段时间以后迅速降解的现象.2,4,5-三氯苯氧乙酸三氯苯氧乙酸除草剂在不同土壤除草剂在不同土壤中的消失情况中的消失情况 土壤和水体受到污染后,特别是受到不容易生物降解的有机物污染后,易发生驯化的现象。从污染物进入环境到污染物开始迅速降解这段时间间隔称为驯化期(acclimation period),或称适应期(adaptation period)、停滞期(lag period)。驯化期长短1小时到几个月不等。某
9、些有机化合物的驯化期某些有机化合物的驯化期驯化及其在污染物处理中的应用工业废水处理:活性污泥的驯化。开始时,用少量工业废水,一定时间后,增大工业废水比例。菌种筛选上的应用:通过人工措施使微生物逐步适应某种特定环境,最后获得有较高耐受力的特定微生物。2 驯化的后效应驯化期的结束标志着降解期的开始。经过一段时间后,再加入相同的化学品,可能出现的现象包括:立即降解,没有停滞期停滞期很短一旦渡过驯化期,后效应可能持续较长时间。但有的化合物没有驯化效应3 农药加速降解现象农药的加速降解(accelerated pesticide degradation)或促进生物降解(enhanced microbia
10、l degradation).具有此现象的农药:2,4-D;2甲4氯;灭草敌;丁草敌无此现象的农药:莠去津(atrazine);西马津;毒死稗等。在生产上,为了延长农药的作用期,需要使用延缓剂,主要是抑制降解生物的活性。丁草敌的延缓剂是地虫硫磷和二乙磷。4 影响驯化的因素1)环境因子:温度,pH,通气性,NP浓度。2)地点:有些微生物在一个地点可以被驯化,但在另一地点则不然。3)基质的降解性5 产生驯化期的原因1)初始群体太小通常在土壤、天然水和污水、废水中能够利用合成有机化合物的微生物群体数量是很少的,有时只有几个。2)毒物的存在。一是污染品浓度太高,有毒;二是污染品中含有高毒化合物作用方式
11、:单纯抑制:仅使降解菌生长受到抑制抑制快生菌:快生菌本身就是优势菌毒性产生:毒性在降解过程中产生毒性消除:存在于污染物中的毒物逐渐挥发降解消失。3)原生动物的捕食作用:证明:在污泥降解中,加有原生动物抑制剂的驯化期明显缩短。4)新基因型的出现期间,发生高效降解基因的突变和转移,然后形成优势微生物。这个过程需要的时间就是驯化期.此现象不多见.5)二次生长 两种基质或者多种基质存在,易降解基质对后续基质的降解产生了阻碍作用.6)酶的诱导和停滞期酶的诱导通常很短,几分钟或几分小时,但对驯化长短也有一定影响,或者其间受到了阻碍.二、菌株接种1 接种的目的:在环境中有各种各样具有降解能力的微生物群落,如
12、能充分利用,有机物就会迅速降解。如果污染点菌降解效率差,是否有必要对污染地点进行接种?要根据具体情况通过实验来确定。接种(inoculation)又叫生物强化(bioaugmentation)目的是:1)加速污染物的降解:污染物有可能快速扩散;2)克服微生物的不均匀性:和污染物相遇比较困难;3)缩短驯化期4)恢复微生物区系:原有物种被破坏,加入新物种.2 菌株的富集(enrichment)和分离(isolation)1)一般降解菌的富集和分离)一般降解菌的富集和分离富集培养技术:这是一种常用的选择性培养技术。做法是:选择某些因子(炭源、氮源、通气条件、受氢体,温度、pH,或光照)造成特殊的环境
13、条件;若要分离特定有机物的降解菌,富集时就要用该有机物作为唯一的碳源和能源。不添加其他有机物,但要添加无机盐。采用含有各种微生物的样品(如天然长期受污染土壤或污泥),如没有也可利用现有微生物种类比较丰富的物品(肥沃土,污泥等)油田的污泥和沉积物含有大量的石油降解菌,是很好的材料。因为这些材料是经过自然选择和富集的。这些材料中 特种微生物的数量很高。让最能适应该生长条件的微生物生长速率超过其他微生物并占优势。自同样条件下反复培养,最后在含有同样成份的固体平板上进行培养,就很容易地将富集到的株系分离出来。2)异生素降解菌富集和分离技术)异生素降解菌富集和分离技术异生素往往具有高毒性,非水溶性,高挥
14、发性和不稳定性。A 困难与解决办法困难与解决办法 毒性:一些异生素,如低分子溶剂,本身对微生物具有较高的毒性。一般1%就可以杀灭微生物。办法:=加入土壤,通过吸附降低毒性。微生物的可耐受浓度通常是50-100 g/g=不断向基质加入低浓度的异生素 憎水性解决办法是通过分散作用或使用惰性亲水载体增加界面。使用两相(水-有机溶剂)系统对难降解有机物降解菌的富集、筛选十分有效。如:水相为无机盐溶液,有机相为惰性溶剂如正十六烷、环庚烷和硅油。难降解的污染物溶解在有机相中,微生物在两相界面或水相中利用污染物。挥发性办法:不断添加或在密闭系统中进行 热稳定性有的异生素热稳定性差,造成消毒困难。采用过滤法消
15、毒。B 常用分离技术常用分离技术观察浑浊度和菌落生长比一般菌困难,因为:异生素分解菌生长很慢,不容易将它们和噬寡碳营养菌区分开;异生素不能做唯一碳源时,必须补充加入少量复杂有机物如酵母膏或土壤浸液,增加了复杂性;异生素的不溶性使培养液混浊,增加了判断的复杂性。残留分析和生长情况的判断将异生素分离提取后,用GC,LC,和化学方法测定,如生物呼吸仪也可用同位素14C标记技术测定 降解菌落的选择从固体培养基上挑选所需菌落,一般需要利用菌落的生理特征区别菌落。例如,降解菌菌落会溶解培养基周围的不溶物而在菌落边缘形成透明带。超声乳化克服均匀分布的困难:先将异生素在器皿上形成薄层,再超声乳化成乳浊液。显色
16、技术:加入显色剂 3)共代谢基质降解菌的富集与分离)共代谢基质降解菌的富集与分离由于共代谢是不与微生物生长相联系的基质降解过程,使用降解基质作为唯一碳源行不通。通常采用的办法有:类似物富集技术选择与基质类似的物质加入到体系中,获得的纯培养物能共代谢该化合物。类似物与共代谢物具有相同的碳骨架,但不会阻断生物降解和基质利用 相关酶的测定:测定特定酶活性来筛选菌株.4)同生菌的富集和分离)同生菌的富集和分离具有协同共栖关系的两个或多个微生物种群叫同生菌(Consortia)。常见同生菌富集失败的原因:不存在降解菌.使用方法不当:浓度不当;培养基缺乏生长因子;使用纯培养方法.具体案例:加入有机物到土壤
17、快速降解,但在培养基中分离不到降解菌,原因可能有:培养基缺乏营养(一种微生物负责降解,但需要其它生物提供生长因子,而第二种生物又以前一种生物的代谢产物生长,构成共生关系)协同共栖(共同降解):两种微生物只能协同降解同一种污染物。即使加入生长因子或满足其他条件也不能使同生菌中的每个菌团独立存在。恒化器恒化器是一种设法使培养液流速保持不变,并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。这是一种通过控制某一种营养物的浓度,使其始终成为生长限制因子的条件下达到的,因而可称为外控制式的连续培养装置。可以设想,在恒化器恒化器中,一方面菌体密度会随时间的增长而增高,另一方面,限制生
18、长因子的浓度又会随时间的增长而降低,两者互相作用的结果,出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平衡。这样,既可获得一定生长速率的均一菌体,又可获得虽低于最高菌体产量,却能保持稳定菌体密度的菌体。恒化器恒化器主要用于实验室科学研究中,尤其用于与生长速率相关的各种理论研究中。恒化器是种群分离的有效手段。向恒化器中接种土壤或其他环境样品,并不断地提供试验有机物溶液作为唯一碳源和能源,生长快的微生物就保留下来,其他微生物被逐渐淘汰。6)“加速进化加速进化”与富集分离与富集分离活体的遗传工程(in vivo genetic engineering)又称“质粒协助分子育种(plasmid-a
19、ssisted molecular breeding)”它利用环境中存在的微生物在选择性压力下于恒化器中长期培养,通过各种微生物间质粒的自然传递和相互作用质粒的自然传递和相互作用来完成构建新菌株的目的,加速了新的异生素降解菌自然进化的过程。p加速进化与遗传工程的区别:自然过程,加速了生物的进化,培养的微生物最终会在自然界出现;人工过程,微生物可能是“人造”的3 接种成功的案例在反应器中、固体床反应器中、砂滤池处理的地下水中,接种微生物一般会取得成功。但在自然土壤、含水层及地表水中接种不易成功。修复成功案例可作为实际应用的重要参考(多来自文献).土壤:加入假单胞菌菌株和联苯可以使土壤中的PCBs
20、消失。4 接种失败的原因p在实验室培养得到的微生物,接种到环境中后并不具有优势,导致接种失败。亦可作修复时的参考所用.营养限制:浓度过低,微生物不能大量繁殖捕食者和寄生物限制:微生物被不断“猎杀”或消耗移动能力:不能进入土壤内部繁殖其他(基质浓度太低,pH,毒物等)三、基因工程菌利用遗传工程技术可以构建“新”的微生物。这些新微生物具有现有微生物不具备的分解代谢能力,或者能在现有微生物不适合的条件下进行分解活动。应用:构建新的微生物创造新的代谢途径增加微生物某个代谢酶的数量和活性创造能降解多种污染物的超细菌创造某种特定性质的细菌基本概念DNA-mRNA(转录);mRNA-蛋白质(转译)蛋白质构成
21、细胞结构物质,酶可促进特定生化反应染色体(chromosome)-DNA来源之一质粒(plasmid)-DNA来源之二质粒的特点:1)自我复制(self-replication)2)共价闭合环状结构(covalent closed circular DNA):自身再次扭曲成再次螺旋结构3)质粒的相容性(compatibility)与不相容性(incompatibility):共存或不共存于同一细胞 4)质粒的消除、整合(和染色体)和重组(质粒间)5)质粒的转移性:转化(transformation):在细胞之间不接触或没有载体介入的情况下的基因转移。受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段,通过
22、交换,把它整合到自己的基因组中,受体菌获得部分新的遗传性状。转导(transduction):以噬菌体为媒介,把供体细胞的一小段DNA片段携带给受体细胞。接合(conjugation):供体菌(F因子菌株,F+)通过性纤毛与受体菌(不含F因子,F-)相接触,F+传递不同长度的单链DNA给F-。转化(细胞间不接触或无载体)、转导(噬菌体为媒介)和接合(通过纤毛)接合和转导可以在自然环境中发生,转化这一般需要在接合和转导可以在自然环境中发生,转化这一般需要在人工条件下进行。人工条件下进行。质粒的种类:F质粒:致育质粒(fertility factor),决定细胞性别;抗药质粒:resistance
23、 factor,使药物失活;抗重金属质粒;降解质粒.质粒自我复制和菌间转移可使受体细菌具有“新”功能,修复研究中特别关注其是否具备新的降解能力;人类利用分子生物学,可剪接DNA至质粒,然后导入宿主细菌,形成新的菌种基质重组体和遗传工程菌 定义:即通过转化、转导或接合作用产生新的细菌菌株。1 多质粒菌株的构建美国构建“多质粒超级菌”(multplasmid super bug)消除海上石油污染。将不同假单胞菌的不同菌株的四种降解性质粒接合转移到一个菌株中,构建成一株能同时降解芳香烃、多环芳烃、萜烃、和脂肪烃的超级细菌。基因重组2 基因工程菌的构建3 原生质体融合技术 定义:通过人为的方法,使遗传
24、性状不同的两细胞的原生质体发生融合,并进而发生遗传重组,以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子的过程。包括各种原核和真核细胞,如细菌和动植物、人类。操作步骤如下:操作步骤如下:第三节 土壤理化性状小小孔孔隙隙大大孔孔隙隙p3.土壤孔隙土壤孔隙单个土粒单个土粒团聚体团聚体微团粒微团粒形形成成阶阶段段与与步步骤骤 土壤固、液、气三相的容积分别占土体容积的百分率,称为固相率、液相率(即容积含水量或容积含水率,可与质量含水量换算)和气相率。三者之比即是土壤三相组成 土壤孔隙度土壤孔隙度(或孔度或孔度):):单位土壤容积内孔隙所占的百分数。孔隙度1固相率 液相率气相率孔隙度的推导孔隙度的推导 无效
25、孔隙无效孔隙:当量孔径 0.01 mm的孔隙,其中 0.2 mm的粗孔植物的细根可伸入其中;0.20.01 mm的中孔是原生动物、真菌和根毛的栖身地。适宜的孔隙状况 耕层土壤(015cm)的总孔隙度为50 60%,其中通气孔隙度为15 20%,底层土壤(15 30cm)分别为50%和10%。p4、土壤水、土壤水 所有的水只有进入土壤转化为土壤水,才能被植物吸收利用。土壤水是作物吸水的最主要来源。土壤水是土壤的最重要组成部分之一。土壤水是土壤的最重要组成部分之一。土壤水是土壤形成发育的催化剂;土壤水是土壤形成发育的催化剂;土土壤壤水水并并非非纯纯水水、而而是是稀稀薄薄的的溶溶液液。土土壤壤水水实
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