第五章生物芯片与微流控技术.doc

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1、第五章 生物芯片与微流控技术第四节 微流控技术4.1微流控技术及微流控芯片微流控（microfluidics）是一种精确控制和操控微尺度流体，尤其特指亚微米结构的技术。在20世纪80年代兴起，是一个涉及了工程学、物理学、化学、微加工和生物工程等领域的交叉学科1。微流控研究的空间特征尺度在微米量级，介于宏观尺度和纳米尺度之间，流体运动显示出二重性：一方面，微米尺度仍然远大于通常意义上分子的平均自由程，因此，对于其中的流体而言，连续介质定理成立，连续性方程可用，电渗和电泳淌度与尺寸无关；另一方面，相对于宏观尺度，微米尺度上的惯性力影响减小，粘性力影响增大， 雷诺数变小，层流特点明显，传质过程从以对

2、流为主转为以扩散为主，并且面体比增加，粘性力、表面张力及换热等表面作用增强，边缘效应增大，三维效应不可忽略。微流控芯片（microfluidic chips，又称芯片实验室）是微流控技术实现的主要平台和技术装置, 其主要特征是容纳流体的有效结构（通道、反应室和其他某些功能部件）至少在一个维度上为微米级尺度。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度高等特点，可在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的分析，并且可在线实现样品的预处理及分析全过程。芯片实验室的代表性技术就是针对极小量（10-910-18 L）的流体进行操控的微流控技术。芯片实验室也包括了非流动的静态微型实验系统，通常

3、为微阵列芯片（micro-arrays），如基因芯片、蛋白质芯片等生物芯片。这类芯片可以认为是微流控芯片的特殊类型，其特点是流体的流量通常未被控制，一般通过检测点阵上的不同反应来进行分析。作为一种新兴的科学技术，微流控受到许多从事物理科学、生命科学以及工程科学的研究者的广泛关注。科研市场和医疗的需求，加上微纳米加工技术的日益成熟，催生了微流控芯片技术并加速了它的发展。如在医疗健康、检验检疫、环境监测、劳动保护、司法鉴定等领域，以及微量分子分析、分离分析技术的微型化以及分子生物学研究领域的大通量和低消耗的实验技术的迫切需求，成为微流控芯片技术发展的巨大推动力。20世纪后期迅速发展的微电子工业积累

4、了大量的微流控芯片加工所必需的理论和技术，许多相关设备、仪器和新材料应运而生。近年来，微流控研究发展迅速，技术创新层出不穷，应用领域不断拓宽。微流控芯片技术从概念提出到诞生和发展，都离不开微加工技术。微加工技术的发展与微流控芯片的发展息息相关。首个现代意义上的微流控装置可能是1975年斯坦福大学Terry等2发明的。他们利用微加工手段，在一片硅晶片上蚀刻出了微细的管道，用作气相色谱的色谱柱，进行微量气体分离分析的研究。1990年，Manz等人提出微全分析系统（micro total analysis system，TAS）的概念3，微流控芯片进入快速发展时期。新材料应用和发展使得微加工本身的内

5、涵也得到了丰富。1998年，Whitesides GM提出了软蚀刻技术的概念，从此宣告微流控芯片进入了以弹性聚二甲基硅氧烷为关键材料的时代4。随着微流控芯片技术的逐渐展开及微分析技术的需求，芯片构型设计越加丰富，出现了一系列形式各异、具有多种微通道网络结构的芯片构型。如电泳芯片分离通道的网络形状主要有：直线型、螺旋型、弯曲蛇形、多边形、折叠形等。由于生化分析的复杂性和多样性需求，微流控芯片技术的发展趋于组合化和集成化，经常需在一块芯片基片上集成多种功能单元，如化学反应器、生物反应器、过滤装置等以进行多种样品的分析检测，以用于DNA测序和突变点检测，氨基酸、蛋白质、细胞检测和药物筛选等。基于高通

6、量快速分离的需要，多通道阵列并行操作是微流控芯片的发展趋势，芯片通道数量已从最初的12通道、96通道，发展到384通道。4.2微流控芯片的制备微流控芯片通过微细加工技术集成各种不同功能的单元，如微反应池、微泵、微阀、检测单元等。微通道加工技术与以硅材料二维和浅深度加工为主的集成电路芯片不同。微流控芯片微通道的两个重要指标是深宽比和微通道界面形状。深宽比指在基片上形成的微结构的深度特征与宽度特征之比，高深宽比结构加工难度较大。对于直接加工法，形状特征与腐蚀的方向性有关，即各向同性或各向异性会形成不同的几何形貌特征；对于复制加工方法，如热模压和模塑法等，微通道几何形状直接与模板形状及加工工艺有关5

7、,6。4.2.1微流控芯片的材料微流控芯片结构设计的首要问题是选取芯片材料，选取材料时考虑的主要因素是： 优良的加工性能，便于大批量生产以降低费用。材料具备良好的加工性能是提高成品率和自动化生产的前提，也是芯片批量生产的前提条件； 生物相容性或化学惰性，不影响分析试剂、药物的化学性质； 散热和绝缘性； 良好的光透性能，适应光学检测的要求。另外还要考虑材料的电渗流特性、表面可修饰性及可密封性能等。在实际操作中，一般根据使用要求有所取舍，但材料应有良好的工艺性以便于未来产品开发。到目前为止，制作微流控芯片的材料主要有：硅、玻璃、石英、高聚物、陶瓷、纸等。选择合适的材料对于制作工艺选择和微流控芯片的

8、成功应用非常重要。1. 硅材料单晶硅是最先尝试使用的芯片基材。硅及二氧化硅具有良好的化学惰性和热稳定性，而且硅的微细加工技术已趋成熟。即使复杂的三维结构，也可用整体和表面微加工技术进行高精度的复制。硅材料的缺点在于易碎、成本高、不透光、电绝缘性差且表面化学行为复杂等，虽然较厚的氧化层（15 m）可以提高其绝缘层，但厚氧化层尚无成熟的键合方法。上述缺点限制了硅材料在微流控芯片中的广泛应用。但由于硅和聚合物材料间的粘附系数小，故现常用来制作聚合物微通道芯片时所用到的模具。2. 玻璃玻璃和石英弥补了单晶硅在电学和光学方面的不足，价廉、易得，具有良好的电渗性和良好的光学性质，为微系统的故障诊断和光学检

9、测提供了便利条件；润湿能力、表面吸附和表面反应性等有利于使用不同的化学方法对其进行表面改性；耐腐蚀性也可满足大多应用的需要。玻璃的微细加工工艺较为成熟，能够满足一般应用需要。由于表面性质与毛细管电泳中的毛细管材料性质基本相同，很多积累的经验和技术可以方便地移植到芯片上来。在发展初期，这一技术极大地促进了微流控芯片的发展。然而，玻璃和石英微流控芯片存在着制作工艺复杂，加工成本过高，而且使用玻璃和石英作基体材料时，通常使用各向同性腐蚀技术，很难获得高深宽比的微结构，深度刻蚀困难，键合温度高和键合成品率低，使芯片性能难以改善，且需要相应的洁净条件和制作设备，工艺过程复杂。玻璃要加工制作复杂的多层结构

10、比较困难，步骤相对繁琐，而且要想制作对液体操控所必需的微泵和微阀是非常困难的。这些都限制了玻璃微芯片的普及化和深度产业化。3. 高分子聚合物与硅和玻璃相比，聚合物材料种类多、选择面广、价格便宜，具有良好的绝缘性和透光性，可施加高电场实现快速分离，成型容易、批量生产成本低，易获得高深宽比的微结构，微通道表面一般不需或仅需较少修饰，绝大部分聚合物材料对生物样品或化学样品具有相容性，更适合于一次性使用，具有广阔的应用前景，已引起国内外极大的关注。用于制作微流控芯片的聚合物主要可分为三类：热塑性聚合物、固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。热塑性聚合物有聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚碳酸酯（PC）和聚乙烯

11、（PE）等；固化型聚合物有聚二甲基硅氧烷（PDMS）、环氧树脂和聚氨酯等；溶剂挥发型聚合物有丙烯酸、橡胶和氟塑料等。其中，常用的有PMMA和PDMS。PMMA材料具有良好的电绝缘性，可施加高电场进行快速分离。透光性好，成本低，成型容易，可选择多种加工方法，如模压法、注塑法、准分子激光微刻蚀加工等，现已得到了极为广泛的应用。弹性高分子材料PDMS（又称硅橡胶），具有价格便宜，绝缘性好，无毒；它的透光性好，能透过250 nm以上的紫外光与可见光，易于检测；成型容易，批量生产成本低等优点。但PDMS材料制成的微结构的稳定性较差，疏水性较强，经常需要进行特别处理来进行改进。选择聚合物做芯片材料时，应根

12、据加工工艺、应用环境及检测方法等诸多因素和聚合物的光电、机械及化学性质选择适用的类型，并注意聚合物材料在所使用的环境下的惰性、电绝缘性、热性能和表面合适的修饰改性方法等。一般应注意以下几个方面的问题： 良好的加工性不同的加工方法对聚合物的加工性有不同的要求。例如，模压法加工时要求芯片材料具有热塑性，而模塑法用的高分子材料应具有低粘度，低固化温度，在重力作用下，可充满模具上的微通道和凹槽等处。由于微通道的构型越来越趋于复杂，高深宽比的微通道的优点很多，所以聚合物材料应具有良好的加工性。 良好的电绝缘性和热性能由于微流控芯片中的液体驱动经常采用电驱动方式，而且芯片经常被用于进行电泳分离，加高压电场

13、会产生热量，高温或局部高温都会对分离效果造成影响，所以材料应有良好的电绝缘性和热性能。 良好的光学性质对于荧光检测和紫外检测而言，材料必须在相应的波长范围内有良好的透光性，才能进行有效的检测。 表面易于修饰改性聚合物材料的表面易于进行改性，如通过紫外、等离子体、激光和化学处理等，不仅可改变电渗流，而且还可减少样品的的吸附。 在使用条件下材料呈化学惰性由于在微分析操作中经常要接触到各种试剂，需要一定抗溶剂能力和耐酸碱能力，因此，在所采用的分析条件下材料应是惰性的。 根据应用场合合理选择当制作普通微流控芯片时，可选用软化温度较低的材料，如有机玻璃或聚苯乙烯；制作PCR与CE集成芯片时，可选用软化温

14、度较高的材料，如聚碳酸酯或聚丙烯等。4. 陶瓷陶瓷材料易碎、透光性不好，但耐高温，有较高的抗压强度，采用软刻蚀或激光加工可制出微通道，适于极限恶劣条件下使用，如航空、太空试验和极地考察等。5. 纸微流控纸芯片（lab-on-paper，纸上微型实验室）是近几年发展的一种新型微流控芯片。用纸张作为基底代替硅、玻璃、高聚物等材料，通过各种加工技术，在纸上加工出具有一定结构的亲/疏水微细通道网络及相关分析器件。与传统的硅、玻璃、高聚物微流控芯片相比，微流控纸芯片具有如下优点： 成本更低。纸张来源丰富，且其价格远低于硅、玻璃/石英、甚至高聚物等材质；可通过简单的光刻、蜡印、喷墨打印、绘图等方式制作二维

15、纸芯片，或通过简单的折纸或多层纸片叠加的方法制作三维纸芯片，因此纸芯片制作简便，其加工成本远低于传统微流控芯片。 分析系统更易微型化、便携化。滤纸本身具有很强的毛细管作用，经图案化疏水性处理即能引导溶液有序流动，因此无需外置的驱动泵；纸张薄（0.07 1 mm），质地轻，且可折叠，因此易于保存和运输。 生物相容性好。滤纸的主要成分为纤维素，具有良好的生物相容性，可以在其表面固定酶、蛋白质和DNA等生物大分子。 检测背景低。纸张通常是白色，有利于在纸芯片上开展比色分析。 后处理简单，无污染。纸芯片使用完后，可通过简单安全的燃烧方法进行处理，不会对环境造成污染。4.2.2微流控芯片的制作技术（1）

16、光刻和刻蚀技术传统的用于制作半导体及集成电路芯片的光刻和刻蚀技术，是微流控芯片加工工艺中最基础的。它是用光胶、掩膜和紫外光进行微细加工，工艺成熟，已广泛用于硅、玻璃和石英基片上制作微结构。光刻和刻蚀技术由薄膜沉积、光刻和刻蚀三个工序组成。复杂的微结构可通过多次重复薄膜沉积-光刻-刻蚀这三个工序来完成。光刻前先要在干净的基片表面覆盖一层薄膜，薄膜的厚度为数埃到几十微米，这一工艺过程称之为薄膜沉积。薄膜按性能不同可分为器件工作区的外延层，限制区域扩张的掩蔽膜，起保护、钝化和绝缘作用的绝缘介质膜，用作电极引线和器件互连的导电金属膜等。膜材料常见有二氧化硅、氮化硅、硼磷硅玻璃、多晶硅、电导金属、光刻抗

17、蚀胶、难熔金属等。制造加工薄膜的主要方法有氧化、化学气相沉积、蒸发、溅射等。在薄膜表面均匀地覆盖上一层光胶，将掩膜上微流控芯片设计图案通过曝光成像的原理转移到光胶层上的工艺过程称为光刻。光刻技术一般有以下基本工艺过程构成：基片的预处理。通过脱脂、抛光、酸洗、水洗的方法使基片表面净化，确保光刻胶与基片表面有良好的粘附。涂胶。在经过处理的基片表面均匀涂覆一层粘性好、厚度适当的光刻胶。胶膜太薄，易生成针孔，抗蚀能力差；太厚则不易彻底显影，同时会降低分辨率。光刻胶的实际厚度与它的粘度有关，并与甩胶机的旋转速度的平方根成反比。涂胶方法有旋转涂覆法、刷涂法、浸渍法、喷涂法等。前烘。在一定的温度下，使光刻胶

18、液中溶剂挥发，增强光刻胶与基片粘附以及胶膜的耐磨性。前烘的温度和时间由光致抗蚀剂的种类和厚度决定，常采用电热恒温箱、热空气或红外热源。前烘温度和时间要合适，若温度过高或时间过长会造成显影时留下底膜或感光灵敏度下降，腐蚀时出现小岛；若温度过低或时间过短，会造成显影后针孔增加，或产生浮胶、图形变形等现象。曝光。将已制备好所需芯片图形的光刻掩膜覆盖在基片上，用紫外线等透过掩膜对光刻胶进行选择性照射。受光照射的光刻胶发生化学反应。在实际操作中，曝光时间由光刻膜、胶膜厚度、光源强度以及光源与基片间距决定。曝光的方式有化学曝光、接触式和接近式复印曝光、光学投影成像曝光。显影。用光胶配套显影液通过化学方法除

19、去经曝光的光胶（正光胶）或未经曝光的光胶（负光胶），显影液和显影时间的选择对显影效果的影响很大。选择显影液的原则是，对需要去除的那部分胶膜溶解度大、溶解速度快，对需要保留的那部分溶解度小。显影时间视光致抗蚀剂的种类、胶膜厚度、显影液种类、显影温度和操作方法而异。坚膜。将显影后的基片进行清洗后在一定温度下烘烤，以彻底除去显影后残留于胶膜中的溶剂或水分，使胶膜与基片紧密粘附，防止胶层脱落，并增强胶膜本身的抗蚀能力。坚膜的温度和时间要合适。刻蚀是将光胶层上的平面二维图形转移到薄膜上并进而在基片上加工成一定深度微结构的工艺。选用适当的刻蚀剂，使它对光胶、薄膜和基片材料的腐蚀速度不同，可以在薄膜或基片上

20、产生所需的微结构。根据刻蚀剂状态不同，可将腐蚀工艺分为湿法刻蚀和干法刻蚀两大类。湿法刻蚀是通过化学刻蚀液和被刻蚀物质间的化学反应将被刻蚀物质剥离下来的刻蚀方法。大多数湿法刻蚀是不容易控制的各向同性腐蚀。其特点是选择比高、均匀性好、对硅片损伤少，几乎适用于所有的金属、玻璃、塑料等材料。缺点是图形保真度不强，横向腐蚀的同时，往往会出现侧向钻蚀，以致刻蚀图形的最少线宽受到限制。干法刻蚀指利用高能束与表面薄膜反应，形成挥发性物质，或直接轰击薄膜表面使之被腐蚀的工艺。其最大的特点是能实现各向异性刻蚀，即在纵向的刻蚀速率远大于横向刻蚀的速率，从而保证细小图形转移后的保真性。干法刻蚀的作用基础是等离子体。用

21、光刻的方法加工微流控芯片时，必须首先制造光刻掩模。掩膜的基本功能是基片受到光束照射时，在图形区和非图形区产生不同的光吸收和透过能力。对掩模有如下要求： 掩模的图形区和非图形区对光线的吸收或透射的反差要尽量大； 掩模的缺陷如针孔、断条、桥连、脏点和线条的凹凸等要尽量少； 掩模的图形精度要高。通常用于大规模集成电路的光刻掩模材料有涂有光胶的镀铬玻璃板或石英板。用计算机制图系统将掩模图形转化为数据文件，再通过专用接口电路控制图形发生器中的曝光光源、可变光阑、工作台和镜头，在掩模材料上刻出所需的图形。或用微机通过CAD软件将设计微通道的结构图转化为图像文件后，用高分辨率的打印机将图像打印到透明薄膜上。

22、此透明薄膜可作为光刻用的掩模, 基本能满足微流控芯片对掩模的要求。（2）热压法热压法（hot embossing）是一种应用较广泛的快速复制电泳微通道的芯片制作技术，适用于PMMA与PC等热塑性聚合物材料。热压法的模具可以是直径在50 m以下的金属丝或是刻蚀有凸突的微通道骨片阳膜，如镍基阳模、单晶硅阳模、玻璃阳模、微机械加工的金属阳模。在热压装置中将聚合物基片加热到软化温度，通过在模具上施加一定的压力，保持30 60s，可在聚合物基片上压制出与模具凹凸互补的微通道。此法可大批量复制，设备简单，操作简便，但所用材料有限。（3）模塑法用光刻和刻蚀的方法先制出阳模（所需通道部分突起），浇注液态的高分

23、子材料，然后将固化后的高分子材料与阳模剥离，得到具有微通道芯片的这种制备微芯片的方法称为模塑法。模塑法的关键在于模具和高分子材料的选择，理想的材料应相互之间粘附力小，易于脱模。微通道的阳膜可由硅材料、玻璃、环氧基SU-8负光胶和PDMS等制造。硅或玻璃阳膜可采用标准刻蚀技术。PDMS模具可通过直接浇注于由硅材料、玻璃等材料制的母模上制得。通过光刻可在SU-8 负光胶上得到高深宽比（20 :1）和分辩率高达几微米的图形，经显影烘干后可直接作模具用。浇注用的高分子材料应具有低粘度，低固化温度。在重力作用下，可充满模子上的微通道和凹槽等处。可用的材料有两类：固化型聚合物和溶剂挥发型聚合物。固化型聚合

24、物有PDMS、环氧树脂和聚氨酯等，与固化剂混合，固化变硬后得到微流控芯片；溶剂挥发型聚合物有丙烯酸、橡胶和氟塑料等，溶剂缓慢挥发而得到芯片。虽然模塑法受限于高分子材料，但该法简便易行，芯片可大批量复制，且不需要昂贵的设备，是一个可以制作廉价分析芯片的方法。（4）注塑法注塑法的工艺是通过光刻和刻蚀技术在硅片上刻蚀出电泳芯片阴模，用此阴模进行24h左右的电铸，得到0.5 cm厚的镍合金模，再将镍合金模加厚，精心加工制成金属注塑模具，将此模具安装在注塑机上批量生产聚合物微流控芯片基片。在注塑法制作过程中，模具制作复杂，技术要求高，周期长，是整个工艺过程中的关键步骤。一个好的模具可生产30 50万张聚

25、合物芯片，重复性好，生产周期短，成本低廉，适宜于已成型的芯片生产。（5）LIGA技术LIGA是德文Lithographie，Galvanoformung，Abformung三个字的字头缩写。LIGA技术是由光刻、电铸和塑铸三个环节组成。第一步为同步辐射深度X光曝光，可将掩膜上的图形转移到有几百微米厚的光刻胶上，得到一个与掩膜结构相同、厚度几百微米、最小宽度为几微米的三维立体结构。电铸可采用电镀的方法，用光刻胶下面的金属进行电镀，将光刻胶图形上的间隙用金属填充，形成一个与光刻胶图形凹凸互补的金属凹凸版图，将光刻胶及附着的基底材料除掉，得到铸塑用的金属模具。通过金属注塑版上的小孔将塑料注入金属模具

26、腔体内，加压硬化后得到与掩膜结构相同的芯片。热塑性高分子材料，如聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚偏二氟乙烯都可以通过注塑的方法复制微流控芯片。LIGA技术已用于高深宽比的聚合物芯片制作，也可用于加工微电机、微泵、微阀等三位微器件。准LIGA技术是用紫外光光源来代替LIGA技术中的同步辐射X光深层光刻，然后进行后续的微电铸和微复制工艺。它不需要同步辐射X光光刻和特制的X光掩膜板，有利于实现微机械器件的大批量生产。根据紫外光深层光刻的工艺路线的不同，准LIGA技术又可分为多层光刻LIGA、硅模深刻蚀LIGA和SU-8深层光刻LIGA三类。（6）激光烧蚀法激光烧蚀法是一种非接触式的微

27、细加工技术。它可直接根据计算机CAD的数据在金属、塑料、陶瓷等材料上加工复杂的微结构，已应用于微模和微通道的加工。用紫外激光使可降解高分子材料曝光，把底片上的二维几何图形精确复制下来。调整曝光强度可控制材料的光解深度。用压力吹扫去除降解产物，得到带有微通道的基片。所得微流控芯片结构具有受热破坏小、通道壁垂直、深宽比大等特点。通常，可根据烧蚀对象选择激光的脉冲强度和脉冲数。该法可应用于制备聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、醋酸纤维素、聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚四氟乙烯等高分子材料芯片。这种方法对技术设备要求较高，步骤简便，而且不需超净环境，精度高。但由于紫外激光能量大，有一定的危险，需在标准激

28、光实验室中进行操作，使用安全保护装备和防护眼镜。（7）软光刻软光刻（soft lithography）是相对于微制造领域中占据主导地位的光刻而言的微图形转移和微制造的新方法，以自组装单分子层、弹性印章和高聚物模塑技术为基础，由哈佛大学Whitesides教授研究组为主的多个研究集体提出的低成本的微细加工新技术。它能制造复杂的三维结构及不规则曲面；能应用于生物高分子、胶体、玻璃、陶瓷等多种材料；没有相关散射带来的精度限制，可以达到30 nm 1 m级的微小尺寸；所需设备简单，在普通实验室环境下能应用，无须特别苛刻的微加工条件和实验条件，一次制成的模板可以多次重复使用，极大地缩短了芯片制作所需的时

29、间，加快研究速度，降低芯片制作的难度和成本。因此软光刻是一种便宜、方便，适于实验室使用的技术。软光刻技术的核心是弹性模印章，可通过光刻蚀和模塑的方法制得。PDMS是软光刻中最常用的弹性模印章。软光刻的关键技术主要包括微接触印刷、再铸模、微传递成模、毛细管成模、溶剂辅助成模等。微接触印刷是指用弹性印章结合自组装单分子层技术在平面或曲面基片上印刷图形的技术。已确定的自组装单分子层体系有烷基硫醇在金银等金属表面和烷基硅氧烷在玻璃、硅、二氧化硅表面等体系。微接触印刷过程非常简单。用一种弹性体PDMS印模通过接触来传递“墨水”上的分子到底物表面。印刷之后，通过含有第二种分子的稀释液来冲洗基底，从而在该图

30、案的非衍生区生成不同的自组装单分子层。软光刻再铸模通常是指用弹性模而不是用刚性模来重新铸模。PDMS的弹性和低表面能有利于弹性模的剥离。在PDMS上再铸模时，可通过机械压制、绑缚、拉紧或以上几种应变的结合，获得比原始印模更小的纳米尺寸。基于再铸模的方法可制作30 nm的有机聚合物结构，其垂直精度达3 nm。微传递成模是在PDMS模具表面滴入预聚合物液体，用扁平的PDMS块刮削或用氮气吹去过多的液体。盛满液体的PDMS模在辐射或高温条件下与底物接触，液体干燥后，小心移去弹性模，在底物表面得到聚合物微结构。微传递成模能够同时产生单独又相互联系的微结构，最为突出的优点是其可方便地在不平滑表面生成微结

31、构，或生成较大面积的微结构，也可一层层地叠加建立三维结构。毛细管成模时将PDMS模置于基底上并与基底表面良好接触，形成一个中空的通道网络，将低粘度的液态预聚合物置于开放的网络通道一端，由于毛细作用，预聚物会自发地逐渐充满整个毛细管网络，干燥后取下PDMS模得到所需的聚合物微结构。溶剂辅助成模是在聚合物基底上制作准三维结构的一种软光刻方法，兼有再铸模和压膜的特点。这种方法的关键是选择一种能溶解聚合物基底却不使PDMS印模溶胀的溶剂。通常这种溶剂要有较高的蒸汽压和表面张力，确保多余溶剂较快蒸发，减小PDMS模的膨胀。 软光刻技术还存在着一些缺陷，如PDMS固化后有1%的收缩变形，而且在甲苯和乙烷的

32、作用下，深宽比将出现一定的膨胀；PDMS的弹性和热膨胀性使其很难获得高的准确性，也使软光刻在多层面的微加工中受到限制；由于弹性模太软，无法获得大的深宽比，太大或太小的宽深比都将导致微结构的变形或扭曲。2000年, 加州理工学院Quake等提出了一种基于PDMS材料的多层软蚀刻技术（multilayer soft lithography）制作新型的气动微阀和微泵的概念。研究组正式应用气动微阀技术以“大规模集成微流控芯片”为题在美国科学杂志上发表文章，介绍集成了上千个微阀和反应器的微流控芯片，标志着芯片从简单的电泳分离到大规模集成化的技术飞跃7,8。如今微流控芯片已经成为涵盖了从分离分析、化学合成

33、、医学诊断学、细胞生物学、神经生物学、系统生物学、结构生物学、微生物学等一系列应用研究领域的综合性交叉学科。第五节 微流控芯片单元高密度集成的微流控芯片装置可以实现高通量并行化的实验以及多种操作单元的功能一体化，作为一种新的方法学平台，已经越来越多地应用于化学和生命科学的研究中。单元操作主要包括进样、样品处理、混合、反应及分离等30。5.1进样及样品前处理单元利用芯片平台处理样品，需要将样品引入芯片的样品处理通道或通道网络，该步骤通常称为进样。进样通常又可分为上样和取样两个步骤。芯片实验室处理的对象是流体，液态样品进样是芯片进样的主流，实际操作中主要有向样品处理通道内引入样品区带、引入样品液滴

34、和引入持续样品流3种情形。区带进样又分为单通道辅助进样、多通道辅助进样和激光辅助进样。在常规操作中，样品往往需要预处理，再引入其它操作单元。将这些预处理操作移植到芯片上，可使芯片具有直接处理实际样品的能力。减小耗样量是使芯片实验室实现实用化和产业化的必要条件。芯片样品预处理操作往往涉及多种试剂、多个步骤和复杂微通道网络，芯片样品预处理单元同时要与外部样品源和后续样品处理单元偶联。 因此，芯片样品预处理具有技术含量高、操作难度大等特点，但蕴含的技术增长点多。常见的芯片预处理操作有萃取、过滤、膜分离、等速电泳和场放大堆积等，其中固相萃取的富集倍数有时可达103，并且较易在芯片上实现， 是芯片平台上

35、最重要的样品处理技术之一。5.2微混合和微反应单元混合是一个物理过程，其目的是实现参与过程的不同组分的均一分布。溶质混合有两种机理：一种为对流传质，另一种为扩散传质。微芯片混合技术具有以下特点： 混合效率高，时间短，能耗少； 易于控制，传质及传热性能好； 设备结构简单，容易与其它功能单元集成。根据输入能量的不同，将微混合器分为被动式和主动式两类。被动式微混合器单纯地利用几何形状或流体特性产生混合效果，除驱动流体流动的压力、电渗驱动等，混合不借助于其它外力，混合器中也不含任何可移动部件，由此又可分为并行迭片、串联迭片、混沌对流和液滴微混合器等。而主动式微混合器则借助磁力、电场力及声场等外力实现混

36、合。微芯片反应技术是一种将微结构的内在优势应用到化学反应过程的技术，体现这种技术的设备或器件被称为微反应器。微反应器是一种单元反应界面尺度为微米量级的微型化学反应系统。它的基本特征是线性尺寸小、物理量梯度高、表面积/体积比大以及流动为低雷诺数层流，其优点是可通过并行单元来实现柔性生产、规模放大、快速和高通量筛选等，与常规反应器相比，微流控芯片反应器传质传热较快，反应条件（如温度、pH值等）易控制。如正电子发射断层扫描诊断中重要的放射性显像药物18氟-2-脱氧葡萄糖的半衰期为110 min，其常规合成需由训练有素的工作人员使用特殊设备花费几十分钟。采用集成大量微阀和微泵的微流控芯片（图1），将合

37、成中的氟化物富集、脱水、标记、脱乙腈、水解五步反应高度集成在微流控芯片上，使合成仅需14 min，产物可直接注射入小鼠体内，从而得到肿瘤分布的清晰图像9。图1. 放射性药物合成所用微芯片示意图95.3 微分离单元早期的微流控芯片是一种集成化的微分离器件，在芯片上进行电泳的研究仍然是微流控领域的主流之一，而电泳分离占有极为特殊的地位。需要强调的是，微流控芯片所涉及的分离只是芯片众多功能操作单元中的一种，尽管很多时候它还会被单独使用。介电泳技术可作为前置过滤（或分离）技术，集成在其它检测系统中来提高检测的灵敏度。Lapizco-Encinas等采用传统的刻烛微加工方法，在玻璃片上加工出多个绝缘柱，

38、利用绝缘直流介电泳同时实现活体和死亡细菌的富集以及分离。由于经加热致死的大肠杆菌的电导率比活体大肠杆菌大，受到的负介电泳力则较小，因此通过施加不同的电压，可首先实现活体大肠杆菌的捕集。随着电压的增加，可继而捕集死亡的大肠杆菌。该系统可实现样品高达3000倍富集，分离效率为100%10。Pysher和Hayes11在PDMS微流控芯片上加工出尺寸规律变化的锯齿状微结构。当在通道两端施加直流电后，会在锯齿处产生不均匀电场，电场强度在样品流动方向上规律性变化。该结构设计可同时使样品受三种电动力的作用：电泳力、电渗流拖拽力和介电泳力。当这三个力在生物体运动方向平衡时，生物体就会被捕集在锯齿附近；当介电

39、泳力较小时，生物体则会在电泳和电渗流作用下随溶液流走。由于同样电场强度条件下，活体生物与死亡的生物体因所受介电泳力不同，从而实现在通道的不同位置分别收集活体和死亡的枯草杆菌、大肠杆菌和表皮葡萄球菌（S.epidermidis）。介电泳技术实现了细菌和病毒的分离和定量研究。Balasubramanian12采用微流控芯片装置，实现了自来水中目标细菌的捕集。该研究使用大肠打菌、沙门氏菌（Salmonella）和海洋细菌（Pseudomonas sp）以及两种病毒来评价装置的工作性能。研究结果表明：在电场强度分别为67 V/cm和 84V/cm条件下，可分别得到90%和99%的捕集效率。Cheng

40、13报道了基于三维AC-DEP和表面增强拉曼散射技术原理的病原体检测微流体芯片装置。该装置集样品过滤、聚焦、分选、捕集和检测功能于一体，可同时实现多种病原体的检测。在通道最左端布设多条平行电极，用以滤除受正向介电泳力的杂质颗粒，而受负向介电泳力的颗粒则顺利流向样品聚焦区域。在聚焦区域，电极布设成锥形，颗粒在负向介电泳力的作用下，被聚焦在通道的中心；在样品分选区域有三个倾斜的电极，用以引导颗粒进入不同的分选通道。在各个分选通道末端设有电极，用于浓缩样品。研究者釆用该芯片装置成功实现了乳酸杆菌（Lactobacillus）和大肠杆菌混合样品的分离以及Gram-(+) S. aureus和Gram-

41、(-) P. aeruginosa的区分检测。基于Sanger末端中止法的阵列毛细管电泳是第一代DNA测序仪所采用的主流技术。基于微流控芯片大规模集成的特点，加州大学伯克利分校的Mathies等设计了一种96通道微阵列电泳微流控芯片，使高通量的DNA 测序第一次得以在微流控芯片上实现14。该芯片采用了转角蜿蜒设计，有效分离管道的长度16 cm，增加了一次电泳分析的可读片断长度，极大地提高了分析的通量。美国哈佛医学院的Toner课题组在微流控芯片上从未经任何处理的全血中分离出了循环肿瘤细胞（circulating tumor cell）15。该芯片采用硅基片，加工出了密集的微立柱，用表面化学的方

42、法在硅基片上修饰了肿瘤细胞抗体EpCAM。当全血流经芯片时，由于细胞与基底的结合力使循环肿瘤细胞被分离出来以便进一步检测。他们用该芯片成功地从117例患有前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌的患者的全血中分离检测到了116 例样品中的循环肿瘤细胞，检出率达到99%。密西根大学的Takayama实验室提出了一种在微流控芯片上简单分离有活力精子的方法16。该方法利用微通道中流体所特有的层流的性质，在Y 形分叉的一个分支中加入精子样品，在另一个分支添加缓冲溶液。由于层流作用，这两股流体在通过合并管道后，除少量扩散外不会有其他因素促进混合，因此绝大多数没有活力的精子细胞会平直地流出，而有活力的精子由

43、于自身的游动会从原有的流层中游出，“主动扩散”到相邻的缓冲液层。该芯片构造极为简单，无须外界注射泵等外源能量的介入，利用表面张力和重力将待测样品从入口一端泵到出口，而有活力的精子在出口有效富集（图2）。图2. 活力精子细胞分选的原理示意图16第六节 微流控技术在生物医学领域的应用6.1细胞培养人类对细胞的结构、组成和功能的了解，绝大多数是建立在大量细胞的系综平均结果基础上的。然而，许多生命现象无法简单地从系综平均上得以理解和阐明，少量细胞乃至单个细胞层次上进行生命科学的研究尤为重要。绝大多数细胞的大小位于微米尺度，与微流控芯片中的通道大小相适应，为操纵少数或者单个细胞提供了极为便捷的条件。微流

44、控芯片是新一代细胞研究的重要平台。微流控芯片所具有的不同操作单元技术灵活组合、整体可控和规模集成的特点在用于细胞研究的过程中主要表现为以下几个方面： 芯片通道尺寸（通常10 100 m）与典型哺乳类细胞直径大小（10 20 m）相匹配，利于单细胞的操纵和分析； 芯片的多维网络结构形成相对封闭的环境， 与生理状态下细胞的空间特征接近； 芯片通道微尺度下传热及传质较快，可提供有利的细胞研究环境， 芯片可满足高通量细胞分析的需要, 有可能同时获取大量的生物学信息； 芯片的多种单元技术的灵活组合使集成化的细胞系统研究成为可能，细胞进样、培养、分选、裂解和分离检测等过程都可在芯片上完成。在芯片细胞培养中

45、，PDMS是采用较多的一种芯片材料，该类材料具有良好的生物相容性，对气体有一定的通透性，有利于细胞培养过程中O2和CO2的气体交换。制造能为生物学研究者乐于接受和易于使用的芯片装置，是微流控芯片发展的一个重要方面。威斯康辛大学的Beebe研究组发明了一种细胞培养芯片。他们利用微通道两端开口处的表面张力差作为驱动力产生持续的流动，控制细胞和相应的溶液，还可利用层流效应来处理管道中的部分细胞。该芯片结合移液器，可进行高通量的细胞培养和实验17。Quake等将微生物培养恒化器集成在微流控芯片上，使大肠杆菌的恒化培养的关键步骤（如洗涤、注入、恒化培养、循环泵流等）实现了自动化。在研究大肠杆菌的基因反馈

46、回路的恒化培养时，发现该装置能维持几百个大肠杆菌的恒化培养长达几天。而在通常大容量体系中，杆菌因数量多会增加基因变异的概率，从而使菌落很快失去基因的自反馈调节。相对于传统方法，该芯片装置更适合长期进行的细菌恒化培养研究，而且具有单细胞水平的分辨率18。哈佛大学的谢晓亮研究组利用微流控芯片技术结合-半乳糖苷酶基因作为报告基因，应用单分子荧光技术将单个酵母和大肠杆菌细胞封闭在微流控芯片的微培养腔室中，研究了单个细胞中蛋白表达的随机性。芯片封闭了单个细菌细胞的微环境，既可使-半乳糖苷酶催化生成的荧光产物迅速地被泵到细胞外，也可很快在微腔室中积累到足以被检测的浓度20。因此微流控芯片从技术上弥补了传统

47、生物学的不足，为细胞中随机过程的研究提供了很好的手段。微流控芯片可将各种细胞操作技术与电泳过程集成为一体，是实现细胞内（特别是单个细胞内）组分分析的重要技术平台。斯坦福大学的Zare研究组设计制作了一种多功能集成的单细胞分析芯片，在芯片中集成了单细胞的分离、操作、细胞裂解、荧光标记等功能单元，在管道下游用聚焦成线状的激光来激发单个分子的荧光并通过高灵敏度的CCD进行收集，计数并分析了单个细胞内极低拷贝数的蛋白质。该方法可对单个细胞中少于1000个的蛋白质分子进行计数，同时通过校正消除PDMS 材料自发荧光的影响19。6.2 PCR反应 传统PCR反应包括变性（95），退火（65）和延伸（72）

48、三个步骤，因此芯片至少应承受95的高温，而能在120条件下长时间使用的PC芯片成为热塑性聚合物微流控芯片的首选。在片PCR改善了热能传输，提高了热循环速度，加快了PCR反应速度，降低了昂贵试剂的消耗。含微混合器、阀、泵、微通道、反应室、加热器和DNA微阵列传感器在内的全集成PC芯片，可实现DNA样品的在片PCR扩增及扩增产物的检测。其中，生物样品（如血液）和免疫磁性捕获微珠溶液装入样品室，清洗缓冲液、PCR反应液、杂交缓冲液分别装在各自储存室内。在样品室内完成在片样品前处理，使血液中的目标细胞被免疫磁性微珠捕获及预浓集后，泵入PCR反应室，清洗缓冲液泵入PCR室，用于纯化捕获细胞。将PCR反应液引入PCR室，关闭反应室周围所有微阀，进行细胞热溶解和PCR反应。完成PCR反应后，打开微阀，杂交缓冲液将PCR产物带入检测室，与靶DNA发生杂交反应，产生电化学杂交信号及检测21。Soper SA等设计了含正方形微通道的PC芯片，用螺钉固定在加热装置上，正方形每一边放置可单独控温的加热块，加热块之间有一定的间隔，以保持各加热区的温度，减少加热区间温度的传递。PCR反应液采用电动连续流驱动的方式进入正方形通道，在通道各边依次加一定电压形成电动连续流，推动PCR样品塞沿正方形通道各边依次进行变性退火延伸复性，完成PCR反应的一个循环