项目7药物体外抗菌试验技术.ppt

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1、项目项目7 7药物体外抗菌试验技术药物体外抗菌试验技术模块模块1 必备知识必备知识药物的体外抗菌试验药物的体外抗菌试验主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，又称药敏试验。主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，又称药敏试验。体外抗菌试验包括抑菌和杀菌两个方面。体外抗菌试验包括抑菌和杀菌两个方面。（一）体外抑菌试验（一）体外抑菌试验体外抑菌试验是最常用的抗菌试验，常用的方法主要有琼脂扩散法和系列稀释法。体外抑菌试验是最常用的抗菌试验，常用的方法主要有琼脂扩散法和系列稀释法。.连续稀释法连续稀释法1)液体培养基连续稀释法液体培养基连续稀释法2)固体培养基连续稀释法固体培养基连续稀释法

2、:平板法、斜面法平板法、斜面法.琼脂扩散法琼脂扩散法 1）滤纸片法）滤纸片法 2）挖沟法）挖沟法 3）管碟法）管碟法4）打孔法）打孔法最小抑菌浓度最小抑菌浓度(MIC)：MIC是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度。通常用是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度。通常用MIC评价药物评价药物抑菌作用的效力，以抑菌作用的效力，以g/ml或或U/ml表示。其值越小，说明抑菌作用愈强。表示。其值越小，说明抑菌作用愈强。(二二)体外杀菌试验体外杀菌试验 用途：用途：评价药物对微生物的致死活性评价药物对微生物的致死活性1最小杀菌浓度的测定最小杀菌浓度的测定 是取是取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别取出并移种

3、于无菌平板上，培养后凡平终点以上未长菌的各管培养液，分别取出并移种于无菌平板上，培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度，即为该板上无菌生长的药物最低浓度，即为该药物的药物的MBC。对微生物广义而言，也可称之为对微生物广义而言，也可称之为最小致死浓度最小致死浓度 (MLC)。某药物能杀死微生物的最低浓度。某药物能杀死微生物的最低浓度。2活菌计数法活菌计数法 在在定浓度的定量药物内，加入定浓度的定量药物内，加入定量的试验菌，作用定量的试验菌，作用定时间后取样稀释，再取定时间后取样稀释，再取定量的此稀释液混入未凝固的琼脂培养基中，立即倾注成平板，培养后计算菌落数。定量的此稀释液混入未凝固的琼脂培养基中

4、，立即倾注成平板，培养后计算菌落数。由于每个菌落是由由于每个菌落是由个菌细胞繁殖而来，则菌落数或菌落形成单位个菌细胞繁殖而来，则菌落数或菌落形成单位CFU)乘以稀释倍数，乘以稀释倍数，再除以稀释液用量，即得该药物与试验菌的混合液中每毫升内存活的细菌数或再除以稀释液用量，即得该药物与试验菌的混合液中每毫升内存活的细菌数或CFU，从而可算出该药物对细菌的致死率。从而可算出该药物对细菌的致死率。3酚系数测定酚系数测定 是用来测定消毒剂效力的一种指标，是以石炭酸为标准，在相同的实验条件下，将是用来测定消毒剂效力的一种指标，是以石炭酸为标准，在相同的实验条件下，将消毒剂和石炭酸的杀菌力作比较，所得的杀菌

5、效力的比值，石炭酸系数消毒剂和石炭酸的杀菌力作比较，所得的杀菌效力的比值，石炭酸系数2为合格。为合格。（三）联合抗菌试验法（三）联合抗菌试验法 同时应用两种抗菌药物时，两种药物之间既可能同时应用两种抗菌药物时，两种药物之间既可能产生相互影响，也可能彼此产生相互影响，也可能彼此不影响不影响；产生影响时，既；产生影响时，既可能是相互加强可能是相互加强(协同作用协同作用)，或两药作用出现累加现，或两药作用出现累加现象象(即两药作用之和即两药作用之和)也可能是相互减弱也可能是相互减弱(拮抗作用拮抗作用)，要确定两种药物之间的作用关系时，通常需用联合抗要确定两种药物之间的作用关系时，通常需用联合抗菌试验

6、法。菌试验法。最简便、最常用的方法：纸条或纸片试验法。最简便、最常用的方法：纸条或纸片试验法。二、药物的体内抗菌试验二、药物的体内抗菌试验 体外抗菌试验有效的药物，还需要经过体内抗菌试验证明有体外抗菌试验有效的药物，还需要经过体内抗菌试验证明有效后，才能推荐应用于临床。效后，才能推荐应用于临床。体内抗菌试验即动物的实验治疗或保护力试验。体内抗菌试验即动物的实验治疗或保护力试验。动物实验治疗的方法，大动物实验治疗的方法，大致是先用致病菌使动物体表或体内感染，造成感染动物模型，然后按不同剂致是先用致病菌使动物体表或体内感染，造成感染动物模型，然后按不同剂量、不同给药方法量、不同给药方法(如腹腔注射

7、、皮下注射、肌肉注射或口服等如腹腔注射、皮下注射、肌肉注射或口服等)以及间隔不以及间隔不同时间进行实验治疗。实验时还要设立一组动物用生理盐水代替药物进行对同时间进行实验治疗。实验时还要设立一组动物用生理盐水代替药物进行对照治疗。然后根据实验组与对照组的动物死亡数或内脏的含菌数，评价药物照治疗。然后根据实验组与对照组的动物死亡数或内脏的含菌数，评价药物的作用和效力。的作用和效力。三、抗菌试验的影响因素三、抗菌试验的影响因素在抗菌试验中应有效控制其影响因素，才能确保试验的科学性和准确性，在抗菌试验中应有效控制其影响因素，才能确保试验的科学性和准确性，主要的影响因素有：主要的影响因素有：试验菌试验菌

8、培养基培养基 供试药物供试药物对照试验对照试验 第二节灭菌制剂的无菌检查第二节灭菌制剂的无菌检查v无菌检查的基本原则无菌检查的基本原则1.严格进行无菌操作严格进行无菌操作2.正确进行样品采集正确进行样品采集v无菌检查用培养基无菌检查用培养基1.需氧菌、厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐培养基需氧菌、厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐培养基 2.真菌培养基真菌培养基3.选择性培养基选择性培养基v阴性对照及阳性对照阴性对照及阳性对照1.阴性对照阴性对照2.阳性对照阳性对照v抑菌试验抑菌试验v无菌检查法无菌检查法v无菌检验结果判断无菌检验结果判断阴性对照应不长细菌，说明培养基本身阴性对照应不长细菌，说明培养基本身是无菌

9、可靠的；阳性对照试验必须长菌，是无菌可靠的；阳性对照试验必须长菌，说明应用的细菌是可以在该试验条件下说明应用的细菌是可以在该试验条件下正常生长的。正常生长的。需氧菌阳性对照菌需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌或藤黄八叠球菌CMCC(B)28001厌氧菌阳性对照菌厌氧菌阳性对照菌：生孢梭状芽胞杆菌：生孢梭状芽胞杆菌CMCC(B)64941真菌阳性对照菌真菌阳性对照菌：白色念珠菌：白色念珠菌CMCC(F)98001或或曲霉菌曲霉菌ATCC16404需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围：范围：(药品、

10、敷料按药品、敷料按中国药典中国药典收载的无菌检查法的规定进行，收载的无菌检查法的规定进行，生物制品应按照生物制品应按照生物制品制造及检定规程生物制品制造及检定规程中有关规定进行中有关规定进行)各种注射剂各种注射剂：用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注射用：用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注射用的无菌水、输的无菌水、输 液、注射剂液、注射剂 原液等。原液等。眼用及外伤用制剂眼用及外伤用制剂：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、溃：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、溃疡和烧伤等外科用药制剂。疡和烧伤等外科用药制剂。外科用的敷料、器材外科用的敷料、器材：如外：如外 科手术用的脱脂棉、纱布、缝合线

11、科手术用的脱脂棉、纱布、缝合线及一次性注射器与一次性无菌手术刀片、输血袋等。及一次性注射器与一次性无菌手术刀片、输血袋等。植入剂植入剂：用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、：用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、免疫药物及抗肿瘤药物等无菌的制剂。免疫药物及抗肿瘤药物等无菌的制剂。可吸收的止血剂可吸收的止血剂：如凝血酶等用于止血并可被组织吸收的各种：如凝血酶等用于止血并可被组织吸收的各种药物制剂。药物制剂。无菌检查法无菌检查法（一）非抗菌剂、无防腐剂、及非油剂药物的无菌检验（一）非抗菌剂、无防腐剂、及非油剂药物的无菌检验 一般药品的无菌检验，通常应用直接接种法。若被检品是液体，

12、可直接接种于培养基内。一般药品的无菌检验，通常应用直接接种法。若被检品是液体，可直接接种于培养基内。若被检品是固体粉末或冻干制剂，则需用无菌生理盐水溶解，或制成均匀悬液再作检验。若被若被检品是固体粉末或冻干制剂，则需用无菌生理盐水溶解，或制成均匀悬液再作检验。若被检品是无菌敷料，则以无菌操作打开包装，于各部位剪取检品是无菌敷料，则以无菌操作打开包装，于各部位剪取1cmX3cm大小的样品，再接种到培大小的样品，再接种到培养基中。养基中。（二）油剂的无菌检验（二）油剂的无菌检验油剂药物与液体培养基不能混溶，故常漂浮于液体培养基表面而影响试验结果。因油剂药物与液体培养基不能混溶，故常漂浮于液体培养基

13、表面而影响试验结果。因此，此类药物做无菌检验时，应在培养基内加入表面活性剂此，此类药物做无菌检验时，应在培养基内加入表面活性剂(吐温吐温80)，使药物均匀，使药物均匀分布于培养基中，以利于细菌的生长和检出。有的药物如青霉素油剂等，由于粘稠度分布于培养基中，以利于细菌的生长和检出。有的药物如青霉素油剂等，由于粘稠度过大，可先用灭菌植物油或灭菌液体石蜡进行一定倍数的稀释，然后取样接种到含吐过大，可先用灭菌植物油或灭菌液体石蜡进行一定倍数的稀释，然后取样接种到含吐温温80的培养基中，充分摇匀使药物均匀分散在培养基中。的培养基中，充分摇匀使药物均匀分散在培养基中。（三）抗菌药物及含防腐剂药物的无菌检验

14、（三）抗菌药物及含防腐剂药物的无菌检验抗菌药物指药物本身为抗菌剂抗菌药物指药物本身为抗菌剂(如抗生素、磺胺药等如抗生素、磺胺药等)以及在药物制剂中含有部分抗菌以及在药物制剂中含有部分抗菌剂剂(如防腐剂如防腐剂)的药物。抗菌药物及含防腐剂的药物进行无菌检验时，与一般药物不同的药物。抗菌药物及含防腐剂的药物进行无菌检验时，与一般药物不同之处在于进行无菌检验前，必须用某些方法使抗菌药物或防腐剂消除、失效，才能不之处在于进行无菌检验前，必须用某些方法使抗菌药物或防腐剂消除、失效，才能不影响对被检药物是否无菌作出确认。影响对被检药物是否无菌作出确认。1 1、灭活法、灭活法、薄膜过滤法、薄膜过滤法、离子交

15、换树脂法、离子交换树脂法4 4、稀释法、稀释法第三节微生物的限度检查第三节微生物的限度检查微生物限度检查项目内容微生物限度检查项目内容：v微生物限度检查的基本原则微生物限度检查的基本原则v染菌量的检查染菌量的检查细菌数细菌数霉菌数霉菌数v控制菌的检查控制菌的检查大肠埃希氏杆菌大肠埃希氏杆菌(大肠杆菌大肠杆菌)金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌沙门氏菌沙门氏菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌(绿脓杆菌绿脓杆菌)破伤风杆菌破伤风杆菌v活螨的检验活螨的检验一、一、一、一、染菌量的检查染菌量的检查1.目的目的细细菌菌数数测测定定我我们们是是为为了了考考察察每每克克或或每每毫毫升升供供试试品品所所污污染染的的活活细细

16、菌菌数数，来来判判明明供供试试品品被细菌污染的程度。被细菌污染的程度。霉霉菌菌的的测测定定是是考考察察每每克克或或每每毫毫升升供供试试品品所所污污染染的的活活的的霉霉菌菌数数，以以此此来来判判明明供供试试品品被被真菌污染的程度。真菌污染的程度。2.测定的方法测定的方法细菌总数的测定细菌总数的测定 营养琼脂平板培养基营养琼脂平板培养基+0.001%三苯四唑氯化物（三苯四唑氯化物（TTC）霉菌总数的测定霉菌总数的测定 玫瑰红钠（马丁）培养基玫瑰红钠（马丁）培养基 二、控制菌的检查二、控制菌的检查1.口服制剂中不能检出大肠杆菌口服制剂中不能检出大肠杆菌2.脏器口服制剂不得检出沙门氏菌和大肠杆菌脏器口

17、服制剂不得检出沙门氏菌和大肠杆菌3.一般外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌一般外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌4.用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不得检出破伤风杆菌。用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不得检出破伤风杆菌。活螨的活螨的检验检验用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨直接观察法：用肉眼直接观察被检药物上有无白点移动，再直接观察法：用肉眼直接观察被检药物上有无白点移动，再用放大镜或解剖镜观察。用放大镜或解剖镜观察。漂浮法：将被检药物放入容器内，加饱和盐水至容器的漂浮法：将被检药物放入容

18、器内，加饱和盐水至容器的处，搅匀，取液镜检，或继续加饱和食盐水至容器口，用载处，搅匀，取液镜检，或继续加饱和食盐水至容器口，用载玻片蘸取液面漂浮物镜检。玻片蘸取液面漂浮物镜检。分离法：将药物放在特制分离器或附有筛网的漏斗内，离药分离法：将药物放在特制分离器或附有筛网的漏斗内，离药物物cm上放置的灯泡，照射上放置的灯泡，照射h.螨有避光螨有避光怕热的习性，便沿漏斗细颈向下爬，在漏斗下口处置一装有甘怕热的习性，便沿漏斗细颈向下爬，在漏斗下口处置一装有甘油水的烧杯，收集爬出的螨，然后在显微镜下观察，根据其形油水的烧杯，收集爬出的螨，然后在显微镜下观察，根据其形态特征、足肢游动情况判断是否为活螨。态特征、足肢游动情况判断是否为活螨。