高效液相色谱分类及工作原理.ppt

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1、第三章高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography，HPLC生物材料和生物体液是目前所知道撮复杂的化生物材料和生物体液是目前所知道撮复杂的化学物质的混合物，所含成分在一万种以上，其学物质的混合物，所含成分在一万种以上，其分子量从分子量从18到几百万，而且其中有意义的化学到几百万，而且其中有意义的化学成分的含量又往往很低，因此，必须要有一种成分的含量又往往很低，因此，必须要有一种高分辨、高灵敏度的分离鉴定手段，气相色谱高分辨、高灵敏度的分离鉴定手段，气相色谱和高压液相色谱具有以上特点，它们可通过对和高压液相色谱具有以上特点，它们可通过对生物样品和生物

2、体液样品的有关成分的提取、生物样品和生物体液样品的有关成分的提取、分离、分析定量，进行对疾病的早期快速诊断分离、分析定量，进行对疾病的早期快速诊断的研究，病理病因的研究，以及药物在体内代的研究，病理病因的研究，以及药物在体内代谢的研究谢的研究等。等。高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分离尤为有利。如氨基酸、多肽、蛋白质、生物离尤为有利。如氨基酸、多肽、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生素、抗菌素等均碱、核酸、甾体、类脂、维生素、抗菌素等均可进行分离分析定量。可进行分离

3、分析定量。第一节第一节 高效液相色谱法概述高效液相色谱法概述一、理论基础：一、理论基础：速率理论速率理论A为涡流扩散项B/u分子扩散项Cu项即传质阻力项二、二、HPLC技术技术 采用高压输液泵，高效微粒固定相和高采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器。灵敏度检测器。三、三、HPLC特点特点 高压、高速、高效、高灵敏度、样品回高压、高速、高效、高灵敏度、样品回收方便。收方便。经典经典LC与与HPLC比较比较 经典经典经典经典LCLCHPLCHPLC柱之内径柱之内径柱之内径柱之内径15cm15cm0.4cm0.4cm长度长度长度长度50100cm50100cm1550cm1550cm填充材

4、料粒度填充材料粒度填充材料粒度填充材料粒度150m200m 150m200m 4m10m4m10m使用压力使用压力使用压力使用压力110atm110atm50200atm50200atm分离时间分离时间分离时间分离时间0.5h0.5h天天天天10min10min与气相色谱法比较，与气相色谱法比较，HPLC的优点的优点1.分析对象广分析对象广 气气相相色色谱谱只只限限于于分分析析气气体体和和沸沸点点较较低低的的化化合合物物；HPLC不不受受样样品品挥挥发发性性和和热热稳稳定定性性的的限限制制，适适用用于于高高沸沸点点、热热稳稳定定性性差差、摩摩尔尔质质量量大大的的物物质质。原原则则上上讲讲，几几

5、乎乎可可以以分分析除永久气体外所有的有机和无机化合物。析除永久气体外所有的有机和无机化合物。流动相对分离起作用流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运载作用，对气相色谱的流动相仅起运载作用，对组分不产生相互作用力；组分不产生相互作用力；HPLC的流动相对的流动相对组分产生相互作用力，相当于增加了一个控组分产生相互作用力，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。制和改进分离条件的参数。经常在室温条件下操作经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行气相色谱法一般在较高温度下进行缺点缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。仪器设备费用昂贵，操作严格。第二节第二节 HPLC的主要类型的主要类型

6、一、一、液一液分配色谱法（液一液分配色谱法（LLPC）在液在液-液色谱中液色谱中,流动相和固定相都是流动相和固定相都是液体液体,它能适用于各种样品类型的分离和分它能适用于各种样品类型的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。溶性的，离子型的和非离子型的化合物。1分离原理分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。系数。所不同的是液液色谱的

7、分配是在柱所不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。效率，从而能分离各种复杂组分。2.固定相固定相 液液色谱的固定相由载体和固定液液液色谱的固定相由载体和固定液组成。常用的载体有下列几类：组成。常用的载体有下列几类：（1）全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等材料制成，直径约材料制成，直径约100 m的全多孔型颗的全多孔型颗粒。粒。这类固定相由于颗粒很细这类固定相由于颗粒很细，孔仍然孔仍然较浅，传质速率快，易实现

8、高效、高速。较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。（2）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）：由直径为：由直径为30 40 m的实心玻璃球和的实心玻璃球和厚度约为厚度约为1 2 m的多孔性外层所组成。的多孔性外层所组成。目前，这种载体粒度为目前，这种载体粒度为5 10 m。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平

9、衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。最大允许量受限制。化学键合固定相化学键合固定相：它是将各种不同有机基它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。它是目前应用最广泛的一种固定相。据统计，约有据统计，约有3/43/4以上

10、的分离问题是在化学以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。键合固定相上进行的。3流动相流动相 根根据据所所使使用用的的流流动动相相和和固固定定相相的的极极性性程程度，将其分为度，将其分为正相分配色谱正相分配色谱和和反相分配色谱反相分配色谱。正相分配色谱：正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性流动相的极性小于固定相的极性，它适用于极性化合物的分离。其它适用于极性化合物的分离。其 流出顺序流出顺序是极性小的先流出，极是极性小的先流出，极 性大的后流出性大的后流出。反相分配色谱：反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性流动相的极性大于固定相的极性，它适用于非极性化合物的分离，它适用于非极性化

11、合物的分离，其其流出顺序与正相色谱恰好相反流出顺序与正相色谱恰好相反二、液一固吸附色谱二、液一固吸附色谱法法(LSAC)(LSAC)液一固吸附色谱是以固体吸附剂作液一固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。吸附作用不同来进行分离的。1分离原理分离原理 当当流流动动相相通通过过固固定定相相（吸吸附附剂剂）时时，吸吸附附剂剂表表面面的的活活性性中中心心就就要要吸吸附附流流动动相相分

12、分子子。同同时时，当当试试样样分分子子（X）被被流流动动相相带带入入柱柱内内，只只要要它它们们在在固固定定相相有有一一定定程程度度的的保保留留就就要要取取代代数数目目相相当当的的已已被被吸吸附附的的流流动动相相溶溶剂剂分分用用）于于是是，在在固固定定相相表表面面发生竞争吸附发生竞争吸附:X+nSad=Xad+nS达平衡时达平衡时,有有 其中其中Kad为吸附平衡常数为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。上保留强，难于洗脱。Kad值小值小,则保留值弱，易则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通值可通过吸附

13、等温线数据求出。过吸附等温线数据求出。2固定相固定相 液液固固吸吸附附色色谱谱所所用用固固定定相相多多是是一一些些吸吸附附活活性性强强弱弱不不等等的的吸吸附附剂剂，如如硅硅胶胶、氧氧化化铝铝、聚聚酸酸胶胶等等。由由于于硅硅胶胶的的优优点点较较多多，如如线线性性容容量量较较高高，机机械械性性能能好好，不不溶溶胀胀，与与大大多多数数试试样样不不发发生生化化学学反反应应等等，因因此此，以硅胶用得最多。以硅胶用得最多。目目前前最最广广泛泛使使用用的的还还是是5 510 10 m的的全全多孔型微粒填料。多孔型微粒填料。3.流动相流动相 一般把吸附色谱中一般把吸附色谱中流动相流动相称作称作洗脱剂。洗脱剂。

14、在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。弱的洗脱剂。三、离子交换色谱法三、离子交换色谱法（IEC）此法是利用此法是利用离子交换原理和液相色谱技离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离

15、，例如氨基酸、核酸、蛋白于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。质等生物大分子。因此，应用范围较广。1离子交换原理离子交换原理 离离子子交交换换色色谱谱法法是是利利用用不不同同待待测测离离子子对对固固定定相相亲亲和和力力的的差差别别来来实实现现分分离离的的。其其固固定定相相采采用用离离子子交交换换树树脂脂，树树脂脂上上分分布布有有固固定定的的带带电电荷荷基基团团和和可可游游离离的的平平衡衡离离子子。当当待待分分析析物物质质电电离离后后产产生生的的离离子子可可与与树树脂脂上上可可游游离离的的平平衡衡离离子子进进行行可可逆逆交交换换，其其交交换换反反应应通通式式如

16、如下：下：阳离子交换：阳离子交换：阴离子交换：一般形式：R一ABRBA达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择系数）：的选择系数）：式中式中Ar，Br 分别代表树脂相中洗脱剂离子分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（和试样离子（B）的浓度，的浓度，A、B则代表则代表它们在溶液中的浓度。它们在溶液中的浓度。KB/A越大，说明越大，说明B离子交换能力越大，越易保离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水离子电荷越大，水合离子半径越小，合离子半径越小，KB/A值就越大值就越大。2.固定相固定相

17、（l l）多孔型离子交换树脂多孔型离子交换树脂 它它主主要要是是聚聚苯苯乙乙烯烯和和二二乙乙烯烯苯苯基基的的交交联联聚聚合合物物，直直径径约约为为5 520m20m，有有微微孔孔型型和和大大孔型之分。孔型之分。（2）薄膜型离子交换树脂 它是在直径约对30m的固体惰性核上，凝聚12m厚的树脂层。（3）表面多孔型离子交换树脂 它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。（4）离子交换键合固定相）离子交换键合固定相 它是用化学反应将离子交换基团键合它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是

18、薄壳玻珠。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。速分离。3.流动相流动相 离子交换色谱法所用流动相大都是离子交换色谱法所用流动相大都是一定一定pH和盐浓度和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值值可控制可控制k值，改变选

19、择性。值，改变选择性。有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同有时也使用有机溶剂如甲醇或乙醇同水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择水缓冲溶液混合使用，以提高特殊的选择性，并改善样品的溶解度。性，并改善样品的溶解度。盐离子的浓度影响：盐离子的浓度影响：如果增加盐离子的浓度，则可降低样品如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。上的保留值。要视不同情况而定。例如，分离有机酸要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的变流动相的pH值来控制。增大值来控制

20、。增大pH值会使酸的值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低电离度增加，使碱的电离度减少；降低PH值，值，其结果相反。但无论属于哪种情况，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电只要电离度增大，就会使样品的保留增大。离度增大，就会使样品的保留增大。pH值的影响：四、离子对色谱法（四、离子对色谱法（IPC）离子对色谱法是分离分析强极性有机酸离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。和有机碱的极好方法。离子对色谱法是将一种（或数种）与溶离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子

21、结加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。的一种色谱法。由于离子对化合物由于离子对化合物A-B+具有疏水性，具有疏水性，因而被非极性固定相（有机相）提取。组因而被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对流水对的能力大小不同以及形成的离子对流水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。这就是留时间不同，因而出峰先后不同。这就是离子对色谱法分离的基本原理。离子

22、对色谱法分离的基本原理。流动相：流动相：加有平衡离子（反离子）的极性加有平衡离子（反离子）的极性 溶液通过改变流动相的溶液通过改变流动相的pH、平平 衡离子的浓度和种类可改变分离衡离子的浓度和种类可改变分离 的选择性。的选择性。固定相：固定相：非极性的疏水键合相非极性的疏水键合相五、离子色谱法（五、离子色谱法（IC）抑制型：抑制型：抑制柱型、连续抑制型抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在 0.010.010.050.05毫摩尔毫摩尔/克干树脂克干树脂非抑制型非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.0070.07毫摩尔/克干树脂

23、),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。离子色谱装置类型离子色谱装置类型 离子色谱连续抑制装置图：离子色谱连续抑制装置图：通通过过分分离离柱柱后后的的样样品品再再经经过过抑抑制制柱柱，使使具具有有高高背背景景电电导导的的流流动动相相转转变变成成低低背背景景电电导导的的流流动动相相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。若若样样品品为为阳阳离离子子，用用无无机机酸酸作作流流动动相相，抑抑制制柱柱为为高高容容量量的的强强碱碱性性阴阴离离子子交交换换剂剂。当当试试样样经经阳阳离离子子

24、交交换换剂剂的的分分离离往往后后，随随流流动动相相进进入入抑抑制制柱柱，在抑制柱中发生两个重要反应：在抑制柱中发生两个重要反应：R R+OHOHH H+ClCl-R-R+ClCl十十H H2 2O OR R+一一OHOH-M M+ClCl-M M+OHOHR R+ClCl-由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的浓度为Cl-离子的26倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。离子色谱的应用：离子色谱的应用：阴离子分析阴离子分析:双柱：薄壳型阴离子交换树脂分离柱双柱

25、：薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流流动动相相：0.003molL-1 NaHCO3/0.0024 molL-1 Na2CO3，流量流量138 mL/hr。七七种种阴阴离离子子在在20分分钟钟内内基基本本上上得得到到完完全全分分离离，各各组组分含量在分含量在350 ppm。六、空间排阻色谱法（六、空间排阻色谱法（SEC）主主要要用用于于较较大大分分子子的的分分离离。与与其其他他液液相相色色谱谱方方法法原原理理不不同同，它它不不具具有有吸吸附附、分分配配和和离离子子交交换换作作用用机机理理，而而是是基基于于试试样样分分子子的的尺尺寸寸和和形形状状不不同同来实现分离的。来实现分离的。1

26、.固定相固定相 排阻色谱固定相种类很多，一般可分为排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。软性、半刚性和刚性凝胶三类。所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。联而具有立体网状结构的多聚体。（1）软软性性凝凝胶胶 如如葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶都都具具有有较较小小的的交交联联结结构构，其其微微孔孔能能吸吸入入大大量量的的溶溶剂剂，并并能能溶溶胀胀到到它它们们干干体体的的许许多多倍倍。它它们们适适用用以以水水溶溶性性溶溶剂剂

27、作作流流动动相相，一一般般用用于于小小分分子子质质量量物物质质的的分分析，不适宜用在高效液相色谱中。析，不适宜用在高效液相色谱中。（2）半刚性凝胶 如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。（3）刚性凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速1cm3s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。2流动相流动相 排阻色谱所选用的流动相必须能排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，溶解样品，并并必须与凝胶本身非常相似，这样才能

28、润湿凝胶。当必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶能溶胀凝胶。溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。子扩散作用而影响分离效果。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。基酸胺和水等。3分离原理分离原理 空间排阻色谱是按分子大小顺序进行分空间排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。离的一种色谱方法。凝胶内具有一定大小的孔穴，凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地

29、被分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。4.4.特点：特点：保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。子结构的某些信息。保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器。度较低的检测器。固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于质量差别必须大于1010才能得以分离。才能得以分离。液相色谱分离类型选择参考表液相色谱分离类型选择参考表