一文读懂分子诊断常用技术.docx

《一文读懂分子诊断常用技术.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一文读懂分子诊断常用技术.docx（13页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、一文读懂分子诊断常用技术本文将按检测的原理对半个世纪中临床常用的分子诊断方法进行归类以分子杂交、核 酸序列测定、分子构象变异与定量PCR4大类对其历史沿革、技术原理与实践应用进行简 要的介绍与评论，以更好的回顾过去，展望分子诊断领域的未来。1961年Hall建立的液相分子杂交法标志着人类掌握分子生物学技术对特定核酸序列 进行检测，开启了对疾病分子诊断的大门。1983年Mullis提出的聚合酶链反应(PCR)概念 更是给分子诊断技术插上了基因扩增的翅膀，大大提高了基因检测技术的敏感度与特异性，降 低了分子诊断的技术门槛。基于分子杂交的分子诊断技术上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛

2、的20年,由于当时尚无法对样 本中靶基因进行人为扩增，人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中 液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现，为基于分子杂 交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。DNA 印迹技术(Southern blot)Southernl于1975年发明了 DNA印迹技术,通过限制性内切酶将DNA片段化，再以 凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离，通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上，再使膜上 的DNA变性与核素标记的寡核甘酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的 DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶

3、切与分子探针杂交，保 证了检测的特异性。因此，一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运 用于各种基因突变，如缺失、插入、易位等，及与限制性酶切片段长度多态性(restriction 物学变量所引起的检测变异，减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术 面临的难题。实时荧光定量PCR(real-time PCR)双链掺入法1992年Higuchi等20-21通过在PCR反应液中掺入漠乙锭对每个核酸扩增热循环 后的荧光强度进行测定提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线，定量反应体 系中初始模板的反应动力学(real-time PCR)模型,开创了通过实时闭

4、管检测荧光信号进行核 酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA双链，且只有嵌入双链时才释放荧光，在每1次的扩 增循环后检测反应管的荧光强度,绘制荧光强度-热循环数的S形核酸扩增曲线，以荧光阈值 与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值(Cycle threshold,Ct),则Ct与反 应体系中所含初始模板数量呈负指数关系推断初始模板量。随后Morrison22提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR Green I进行反应体系中低 拷贝模板定量的方法。这一方法操作简便，但由于仅使用扩增引物的序列启动核酸扩增，其产 物特异性无法得到充分保证。虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物

5、特异 性进行检验，但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测,因此双链掺入法并未在临床实践中 得到认可。Taqman探针由于双链掺入法存在特异性较低的问题,1996年Heid23综合之前发现的Taq酶的5, 核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针的 概念提出了使用Taqman探针进行qPCR的方法。TaqMan探针的本质是FRET寡核甘酸 探针，在探针的5,端标记荧光报告基团3端标记荧光淬灭基团，利用T叫酶具有53外切酶 活性，在PCR过程中水解与靶序列结合的寡核甘酸探针，使荧光基团得以游离，释放荧光信 号。从而使

6、能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光，通过real-time PCR的原理对 其进行定量。由于其超高的特异性与成功的商品化推广,T叫man探针已经成为目前临床使 用最为广泛的qPCR方法，其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测 等方面具有着不可替代的地位。分子信标同样在1996年,Tyagi等24提出了使用分子信标(moleuclar beacons)进行qPCR 的方法，分子信标是5,与3,端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核甘酸探针，其两端 具有互补的高GC序列，在qPCR反应液中呈发夹结构，荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能 量转移(F RET)而保持静息状态。

7、当PCR反应开始后，茎环结构在变性高温条件下打开，释放荧光;在退火过程中，靶序列特 异性探针则与模板杂交保持线性，不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭，通过 检测qPCR体系中退火时的荧光信号强度,便可以real-time PCR原理特异性检测体系中的 初始模板浓度。相比于T叫man探针，分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空 间上紧密结合，大大降低了检测的荧光背景，其检测特异性较Taqman探针更高，更适合等位 基因的分型检测。双杂交探针1997年,Wittwer等25发表了使用分别标记荧光供体基团与荧光受体基团的2条相 邻寡核甘酸探针进行qPCR的方法。双杂交探针所标记的供

8、体基团和受体基团的激发光谱 间具有一定重叠，且2条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。仅当2条探针与靶基因同时 杂交时，供体与受体基因得以接近，从而通过FRET发生能量传递，激发荧光信号，荧光信号强 度与反应体系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了 2条探针进行靶序列杂交，该方法的特异性比传统单探针检测体系得到了极大地提升。数字PCR早在上世纪90年代就出现了使用微流控阵列对单次qPCR反应进行分散检测的概念。基于这一理念Vgelstein 与 Kinzter26T 1999 年发表了数字 PCR(digital PCR)的方 法,对结肠癌患者粪便中的微量K-RAS基因突变进行了定量。相比于传统

9、的qPCR方法，数 字PCR的核心是将qPCR反应进行微球乳糜液化，再将乳糜液分散至芯片的微反应孔中，保 证每个反应孔中仅存在W1个核酸模板。经过PCR后，对每个微反应孔的荧光信号进行检测, 存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号，没有靶模板的反应孔就没有荧光信号，以此推算出 原始溶液中待测核酸的浓度。因此，数字PCR是1种检测反应终点荧光信号进行绝对定量 的qPCR反应，而非以模板Ct值进行核酸定量的real-time PCR。经由Quantalife公司开发(已于2011年被BIO-RAD收购)的微滴式数字PCR是首款 商品化的数字PCR检测系统，目前已被广泛运用于微量病原微生物基因检测、低

10、负荷遗传 序列鉴定、基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统qPCR相 比较，该技术具有超高的灵敏度与精密度,使其成为目前qPCR领域的新星。展望半个多世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。概而言 之，在过去的50多年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升:即报告信号检测从放射核 素标记向荧光标记转化，操作方法由手工操作向全自动化转化，检测分析通量从单一标志物向 高通量多组学联合判断转化;检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。未来，我国分子诊断事业将迎来两方面的进步。随着卫生监管部门对分子诊断重要性的 认识不断深入与越来越多高学历、高素质人才的进入，

11、分子诊断将会出现理念的革命性进步, 高通量技术将更多的进入临床的实际应用中。随着技术的进一步发展,传统针对特定基因异常、病原微生物感染鉴定的方法学,也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足 的进步。对于传统人力与时间成本较高的检测方法学，将出现两极分化的态势，即Southern等经 典的检测金标准将得到保留;而ASO-RDB等灵敏度、特异性均不能满足实际临床需求的方 法将快速被新型技术所取代。最终,分子诊断也必将一改目前仅仅用于病原微生物基因检测 与部分遗传性疾病诊断的局面，形成由肿瘤学、遗传学、微生物学、药物基因组学四足鼎立, 快速发展的景象。fragment length poly

12、morphism,RFLP)的鉴定中。Alwine 等2于 1977 年推出基于转印 杂交的Northern blot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。ASO 反向斑点杂交(allele-specificoligonudeotide reverse dot blot,ASO-RDB)使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性，但存在操作极为繁琐，检 测时间长的缺点。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过 凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等 位基因特异性寡核苛酸探针(allele-specific olig

13、onucleotide,ASO),更使对核酸序列点突变 的检测成为可能。1986年,Saiki3首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结 合起来，实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki4又发明了 ASO- RDB,通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色，进行基因分 型、基因突变的检测。该法可将多种寡核甘酸探针固定于同一膜条上，只需通过1次杂交反 应，即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因，具有操作简单、快速的特点，一度成 为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。荧光原位

14、杂交(fluorescence in situhybridization,FISH)FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin5首次使用荧光素标记探针完 成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH 推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH结 合了探针的高度特异性与组织学定位的优势，可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定 的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针，可实现多种荧光素标记 同时检测数个靶点。如今,FISH已在染色体核型分析，基因扩增、基因重排、病原微生物鉴定等多

15、方面中得 到广泛应用。通过比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)与光谱核 型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技术，使其正在越来越多的临床诊断领域中 发挥作用。多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification.MLPA)MLPA技术于2002年由Schouten等首先报道。每个MLPA探针包括2个荧光标 记的寡核昔酸片段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括1段引 物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡

16、核甘酸片段都与靶序列进行杂交，再使 用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列完全杂交,连接酶 才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补，即使 只有1个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用1对 荧光标记的通用引物扩增连接好的探针，每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后,通过毛 细管电泳分离扩增产物，便可对把核酸序列进行检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原 理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经过MRC- Holla

17、nd公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多 遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系，是 目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。生物芯片1991年Affymetrix公司的Ford。利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片 为载体的微阵列，标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日,芯片技 术已经得到了长足的发展,如果按结构对其进行分类基本可分为基于微阵列(microarray)的 杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。微阵列芯片相芯片：微阵列基因组

18、DNA分析(microarray-based genomicDNAprofiling,MGDP)芯片将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史，其技术平台主要分为2类用微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomehybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNP array)0顾名思义aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化，而单核甘酸多态性 (singlenucleotide polymorphism,SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较，直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信

19、息。随着技术的不断进步，目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因 阵列芯片。MGDP芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及 产前筛查。经验证，使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达 100%8,表达谱芯片(gene expression profilingarrayzGEP array):1999 年Quggan 等 9首次使用cDNA芯片绘制了 mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的 作用日益得到重视,目前也已出现microRNA芯片、长链非编码RNA(long noncoding RNAJncRNA)芯片等。类

20、似于MGDP芯片,GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的 核酸探针进行杂交，从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。相较于基因组杂 交,GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测，对疾病的诊断与预后判断具有 特殊的意义。目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神 经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果；液相芯片：传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列，而Luminex公 司的xMAP技术10则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料,将聚苯乙烯微球标记为不同 的荧光色，并对其进行编码得到具有上百种荧光编号

21、的微球。通过xTAG技术将不同的特异 性杂交探针交联至编码微球上，使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利用混合后的 探针-微球复合物与待测样本进行杂交，使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞 仪,其中红色激光检测微球编码，绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强 度,一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前,该技术已在囊性纤维化等遗传性疾 病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。微流控芯片1992年Harrison等U首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上 构建微全分析系统的构想，通过分析设备的微型化与集成化，完成传统分析实验室向芯

22、片 上实验室(lab-on-chip)的转变。微流控芯片(microfluidic chip)由微米级流体的管道、反 应器等元件构成，与宏观尺寸的分析装置相比,其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比, 以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应 在内的特殊性能,从而在1张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列 实验过程。目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。核酸序列测定测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发

23、展，但其对于核 酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上，因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测 序仍是技术上的金标准。第1代测序1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法，随后 Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型，为核酸测序时代的来临拉开了序幕。Sanger等12于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2与3不含羟基的双脱 氧核甘三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二 酯键,DNA合成反应便会终止。如果分别在4个独立的DNA合成反应体系中加入经核素 标记的特定ddNTP,则可在合成反应后

24、对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自显影，根据电泳条带确定待测分子的核昔酸序列。AppiedBiosystems公司在Sanger法的基础上，于1986年推出了首台商业化DNA 测序仪PRISM 370A,并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检 测体系。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大 大提高。Sanger测序是最为经典的一代测序技术，仍是目前获取核酸序列最为常用的方 法。第2代测序焦磷酸测序(Pyro-sequencing)不同于Sanger

25、测序法所使用的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年 提出了在固相13与液相14载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是 利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光，通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数 量。由于使用了实时荧光监测的概念，焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量，因 此在SNP位点检测、等位基因（突变）频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于 荧光报告原理不同，其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了 5%。但 由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高,目前尚未得到大规模的临床使用。高通量第2代测序目前常见的高通量第二

26、代测序平台主要有Roche 454x Illumina Solexa、ABI SOLiD 和Life Ion Torrent等，其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩 增、在载体面上进行边合成边测序反应，使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩 大至载体上百万级的平行反应，完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录 组等进行真正的组学检测,在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用 药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等 方面已经取得了喜人的成绩。然而，由于该技术需要对DNA进行片段化处理,测序反应读长 较短

27、（如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp）,需要对数据进行大规模拼接，因此对分子 诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求，以利于后期的测序数据分析。第3代测序第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目 前主要有 Helicos 公司的 Heliscope, Pacific Biosciences 公司的 SMRT 和 Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本,可对混杂的基 因物质进行单分子检测，故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化，并 最终投入临床应用仍有很长的距离。基

28、于分子构象的分子诊断技术变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)19701980年间,Fischer等15与Orita等16分别提出了利用核酸序列变异所导致 双链变性条件差异与单链空间折叠差异，通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定 的方法，即DGGE与SSCPO上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异，通过特 定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性，且对于序列的改 变非常敏感，

29、常常1个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE与SSCP均必须进行PCR 后开盖电泳的操作，现已不常见于临床检测。变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)1997年Qefner和Underhill建立17,18了利用异源双链变性分离变异序列、使用色 谱洗脱鉴定的技术，称为dHPLC,可自动检测单碱基置换及小片段核甘酸的插入或缺失。对 于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物，其经过变性和复性过程后，体系内将出现2种 双链:一种为同源双链,由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双 链;另一

30、种为异源双链，即双链中1条单链为野生型，而另1条为变异型。由于存在部分碱基 错配的异源双链DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双 链因存在错配区而更易变性，被色谱柱保留的时间短于同源双链，故先被洗脱下来，从而在色 谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行 检测，可快速检出 5%负荷的变异序列。但需注意的是，由于该技术主要通过异源双链进行 序列变异检测，其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)2003年,Wittwer等19首次革命性地使

31、用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光 被动标记,再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。该技术的原理也是通过异 源双链进行序列变异鉴定。待测样本经PCR扩增后，若存在序列变异杂合子，则形成异源双 链，其熔解温度大大下降。此时由于双链被饱和染料完全填充，其产物熔解温度的变化便可通 过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合子而言,HRMA也可利用其较高的分辨率完成 PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定，但是对于口、HI类 SNP的纯合子变异则无法有效区分。如何利用DNA构象对序列进行推测，从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交 反应一直是分子生物学研究与

32、应用的热点问题。目前，使用构象变化对序列变异进行间接检 测的便捷性已得到一致肯定，尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。 但需要注意的是，由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对 检测的特异性进行严格的保证,因此其只适合大规模的初筛，而真正的确诊仍需要进行杂交或 测序的验证。定量 PCR(quantitative PCR.qPCR)相比于其他分子诊断检测技术,qPCR具有2项优势，即核酸扩增和检测在同一个封闭体 系中通过荧光信号进行,杜绝了 PCR后开盖处理所带来扩增产物的污染;同时通过动态监测 荧光信号,可对低拷贝模板进行定量。正是由于上述技术优势,qPCR已经成为目前临床基因 扩增实验室接受程度最高的技术,在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、 基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。但 伴随着qPCR技术的迅猛发展,有关这项技术的质量管理问题也日益突出，如何消除各类生