第四章 核酸操作的基本原理.ppt

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1、第四章 核酸操作的基本技术第一节第一节 核酸的提取与纯化核酸的提取与纯化制取核酸样品的根本要求是制取核酸样品的根本要求是保持保持核酸核酸的的完整性完整性 防止核酸酶防止核酸酶对核酸的降解、变性或破坏对核酸的降解、变性或破坏一、一、DNADNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法（一）（一）DNADNA提取的基本原理提取的基本原理u DNA DNA是是极性极性化合物，溶于水不溶于乙化合物，溶于水不溶于乙醇、醇、氯仿等有机溶剂氯仿等有机溶剂u DNA DNA多以脱氧核蛋白（多以脱氧核蛋白（DNP)DNP)形式存在形式存在u 提取提取DNADNA时用先将时用先将DNPDNP抽提出来，在将抽提出来

2、，在将DNADNA 分离出来分离出来（二）基本步骤（二）基本步骤破碎破碎细胞并对细胞并对DNADNA快速实施保护快速实施保护破壁：破壁：变性变性:复性复性:将核酸从其它大分子中将核酸从其它大分子中分离出来分离出来使核酸和蛋白质的复合体使核酸和蛋白质的复合体解离解离1.1.液氮研磨液氮研磨 2.2.快速加入提取缓冲液快速加入提取缓冲液1.1.离子变性剂、去污剂离子变性剂、去污剂 2.2.酚、氯仿酚、氯仿1.1.无水乙醇无水乙醇 2.2.异戊醇异戊醇（二）、（二）、DNADNA提取的几种方法提取的几种方法 浓盐法浓盐法 SDS SDS法法 CTAB CTAB法法 苯酚抽提法苯酚抽提法 水抽提法水抽

3、提法1.1.浓盐法浓盐法1M Na clDNPDNP粘液粘液辛醇辛醇+氯仿氯仿乳化乳化乳化乳化保留水相保留水相保留水相保留水相核酸核酸核酸核酸离离心心乙醇乙醇乙醇乙醇破碎细胞破碎细胞2.SDS 2.SDS（十二烷基硫酸钠）法（十二烷基硫酸钠）法SDSSDSSDSSDS55-6555-6555-6555-65裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞离心离心离心离心提高盐浓度提高盐浓度提高盐浓度提高盐浓度降低温度降低温度降低温度降低温度沉淀蛋白沉淀蛋白沉淀蛋白沉淀蛋白质及多糖质及多糖质及多糖质及多糖核酸核酸核酸核酸上清液上清液乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀释放核酸释放核酸3.CTAB3.CTAB（十二烷

4、基三乙基溴化铵）法（十二烷基三乙基溴化铵）法CTABCTABCTABCTAB溶解细胞膜溶解细胞膜与核酸形与核酸形与核酸形与核酸形成复合物成复合物成复合物成复合物低盐溶液低盐溶液高盐溶液高盐溶液溶解溶解溶解溶解沉淀溶于沉淀溶于沉淀溶于沉淀溶于高盐溶液高盐溶液高盐溶液高盐溶液核酸核酸核酸核酸沉淀沉淀离心乙醇沉淀乙醇沉淀4.4.苯酚抽提法苯酚抽提法蛋白分子溶于酚相，而蛋白分子溶于酚相，而DNADNA溶于水相。溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，离心分层后取出水层，多次重复操作，合并含合并含DNA DNA 的水相，用乙醇沉淀的水相，用乙醇沉淀DNA DNA。此法的特点是使提取的此法的特点是使提

5、取的DNADNA保持天然状保持天然状态态 5.5.水抽提法水抽提法利用核酸溶解于水的性质利用核酸溶解于水的性质,用低盐用低盐溶液除去溶液除去RNARNA此法提取的此法提取的DNADNA中蛋白质含量较高中蛋白质含量较高,故一般不用故一般不用.（三）核外（三）核外 DNA 的提取的提取核外核外DNADNA包括：包括：质粒质粒DNADNA 线粒体线粒体DNADNA 叶绿体叶绿体DNA DNA 碱裂解法碱裂解法煮沸法煮沸法去污剂裂解法去污剂裂解法先分离完整的先分离完整的细胞器细胞器提取纯化原理提取纯化原理与质粒与质粒DNADNA相同。相同。二二、RNARNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法（一

6、）（一）总总RNARNA提取的基本原理与方法提取的基本原理与方法 1.1.总总RNARNA提取的基本原理提取的基本原理 RNARNA分离的关键因素是尽量分离的关键因素是尽量减少减少RNA RNA 酶酶 (RNaseRNase)的污染的污染 造成造成RNaseRNase酶污的主要来源有酶污的主要来源有 :所用的所用的器皿器皿、所用的、所用的溶液溶液、实验人员、实验人员的的手及飞沫手及飞沫玻璃器皿：烘箱中玻璃器皿：烘箱中(180)(180)烘烤烘烤 8h 8h 以以上上 ,塑料器皿：塑料器皿：0.1%DEPC(diethylpyrocarbonate,0.1%DEPC(diethylpyrocar

7、bonate,二二乙基焦碳酸盐乙基焦碳酸盐)浸泡或用氯仿洗涤浸泡或用氯仿洗涤 ;配置的溶液应尽可能用配置的溶液应尽可能用 0.1%DEPC0.1%DEPC在在3737处理处理12h12h以上以上,然后高压灭菌然后高压灭菌 ;全部实验过程均需戴手套操作全部实验过程均需戴手套操作,并经常并经常更换更换 ;RNA RNA 电泳槽常用去污剂洗涤电泳槽常用去污剂洗涤,0.1%DEPC,0.1%DEPC处理处理2.2.总总RNARNA提取的方法提取的方法异硫氰酸胍异硫氰酸胍 -氯化铯超速离心法氯化铯超速离心法盐酸胍盐酸胍-有机溶剂法有机溶剂法氯化锂氯化锂 -尿素法尿素法（二）（二）mRNA mRNA 的提

8、取的提取一般有两条途径：一般有两条途径：其一是其一是先先提取细胞提取细胞总总 RNA,然后然后再再从中从中分离带分离带 poly(A)的的 mRNA;其二是先提取其二是先提取多聚核糖体多聚核糖体,再将蛋再将蛋白质与白质与 mRNA 分开。分开。三、核酸的检测三、核酸的检测紫外分光光度法紫外分光光度法琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法1.1.紫外光度法原理：紫外光度法原理：DNA DNA或或RNARNA分子在分子在260 nm260 nm处有特异处有特异吸收峰，吸收强度与系统中吸收峰，吸收强度与系统中DNADNA或或RNARNA的浓度成正比。的浓度成正比。方法：方法：首先用首先用TETE或或ddH

9、2OddH2O稀释待测稀释待测DNADNA样品样品用用TETE或或ddHddH2 2O O为空白对照，在为空白对照，在260 nm260 nm及及280 nm280 nm处调节紫外分光光度计读处调节紫外分光光度计读数为数为0 0加入加入DNADNA稀释液与上述两波长处读取稀释液与上述两波长处读取ODOD值。值。浓度计算（单位：浓度计算（单位：gg/ml)/ml)双链双链DNADNA（dsds DNA DNA）=5050ODOD260260稀释倍数稀释倍数 RNA(ssRNARNA(ssRNA)浓度浓度 =4040 OD OD260260稀释倍数稀释倍数 单连单连DNADNAssDNAssDNA

10、 =3333 OD OD260260稀释倍数稀释倍数 纯度检测纯度检测可通过可通过ODOD260260/OD/OD280280来衡量来衡量ODOD260260/OD/OD280280为为1.81.8左右为好左右为好 1.81.8为为RNARNA污染，污染，1.81.8为为蛋白质蛋白质污染污染 2.2.琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法核酸分子是多聚阴离子核酸分子是多聚阴离子,在电场中向正在电场中向正电极的方向迁移电极的方向迁移在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNADNA分子的电泳分子的电泳迁移率，取决于核酸分子本身的大小和迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。构型。原理：原理：DNAD

11、NA与溴化乙锭（与溴化乙锭（EBEB）形成的络合物形成的络合物 在紫外光照在紫外光照射下能发射荧光，荧光的强射下能发射荧光，荧光的强度与度与DNADNA的的含量成正比。含量成正比。因此可十分敏感而方便因此可十分敏感而方便地检测出凝胶介质中地检测出凝胶介质中 DNA DNA。根据谱带的形状可反应根据谱带的形状可反应DNADNA的质量的质量同时同时 ,通过同已知分子质量通过同已知分子质量的标准的标准 DNA DNA 片段之间的比较片段之间的比较 ,还可测定出随迁移的还可测定出随迁移的 DNA DNA 片段的分子质量。片段的分子质量。四四 核酸的保存核酸的保存(一一)、影响核酸保存的关键因素影响核酸

12、保存的关键因素 关键的因素是保存液的关键的因素是保存液的酸碱度酸碱度和保存和保存温度温度。1.1.保存液的酸碱度保存液的酸碱度 水、过酸过碱可以断裂核酸的氢水、过酸过碱可以断裂核酸的氢键键 2.2.保存温度保存温度 温度升高会降低核酸的稳定性温度升高会降低核酸的稳定性,所以所以 核酸一般都是低温保存。核酸一般都是低温保存。(二二 )、核酸制品的保存方法、核酸制品的保存方法保存条件保存条件 溶液：溶液：TE(TE(tris-Hcltris-Hcl EDTA EDTA pH8.0)pH8.0)ddH ddH2 2O O 温度：温度：-70 -70 一年以上一年以上 -20 -20 半年左右半年左右

13、 4 4 数月内数月内第二节第二节 凝胶电泳技术凝胶电泳技术核酸分子是多聚核酸分子是多聚阴阴离子，在电场中向离子，在电场中向正正极的方向迁移极的方向迁移在一定的电场强度下，在一定的电场强度下，DNADNA分子的分子的迁移率迁移率取决于核酸分子本身的取决于核酸分子本身的大小和构型大小和构型一、电泳的原理一、电泳的原理基质：基质：常熔点琼脂糖常熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖分辨能力：分辨能力：0.2-50kb0.2-50kb 凝胶凝胶浓度越大浓度越大，分辨能力，分辨能力越强越强1琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖凝胶电泳（agroseagrose gel gel electrophisiselectro

14、phisis）2.2.琼脂糖电泳的影响因素琼脂糖电泳的影响因素1 1、DNADNA的分子大小的分子大小:迁移速率与迁移速率与DNADNA分子量对数分子量对数成反比成反比2 2、琼脂糖浓度琼脂糖浓度迁移率的对数与凝胶浓度成迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系线性关系。0.5kb 10kb 10kb胶浓度为胶浓度为0.3-0.7%,0.3-0.7%,两者之间则所需胶浓度为两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%0.8-1.0%。3 3、DNADNA分子的构象分子的构象 SCOL,L SCOL,L4 4、电源电压、电源电压 在在低电压低电压(5v/cm)5v/cm)时时,迁移速率与电压迁移速率与电压成成正

15、比正比 5 5、嵌入染料、嵌入染料 溴化乙啶使线状溴化乙啶使线状DNADNA迁移率迁移率降低降低1515。6 6、离子强度影响离子强度影响 pH pH 影响影响DNADNA分子所带的分子所带的电荷电荷 (TAE TBE)(TAE TBE)二、琼脂糖变性胶电泳二、琼脂糖变性胶电泳未变性未变性的的RNARNA，电泳时与电泳迁移率，电泳时与电泳迁移率没有严没有严格格的相关性的相关性在在变性条件变性条件下电泳，才能使下电泳，才能使RNARNA移动距离与移动距离与其相对分子量对数其相对分子量对数成正比成正比。RNARNA变性剂有二种，变性剂有二种，乙二醛乙二醛-二甲基亚砜二甲基亚砜（DMSODMSO）甲

16、醛甲醛三三.聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）PAGE PAGE 为垂直板凝胶电泳为垂直板凝胶电泳基质：基质：由由丙烯酰胺丙烯酰胺单体和单体和甲叉甲叉丙烯酰胺双体聚合丙烯酰胺双体聚合分辨能力：分辨能力：其分辨力为为其分辨力为为1bp-4kb1bp-4kb范围之间的范围之间的DNADNA片段片段 凝胶凝胶浓度浓度越越大大，分辨能力越，分辨能力越强强 四、脉冲电场凝胶电泳（四、脉冲电场凝胶电泳（PFGEPFGE）在在琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶上外加上外加正交的交变正交的交变脉冲电场脉冲电场,大分子的大分子的DNADNA需需调整调整其涌动方向其涌动方向,DNA,DNA分子分子 越大

17、重排所需时间就越长越大重排所需时间就越长可分离可分离50Kb-Mb50Kb-Mb(10(107 7 bpbp)级的级的DNADNA五、凝胶电泳的检测五、凝胶电泳的检测琼脂糖凝胶用琼脂糖凝胶用 EB GelRed GelGreen聚丙烯酰胺凝胶用聚丙烯酰胺凝胶用 硝酸银硝酸银 同位素同位素第三节第三节 核酸分子杂交核酸分子杂交一、核酸分子杂交一、核酸分子杂交1.1.原理：原理：双链双链DNADNA或具有二级结构的或具有二级结构的RNARNA变性变性后，后，具有具有互补序列互补序列的两条单链的的两条单链的退火退火复性复性过程过程 若退火的核酸来自若退火的核酸来自不同不同的生物有机体，的生物有机体，

18、则称形成的双链分子就叫做则称形成的双链分子就叫做杂合杂合分子。分子。一、标记的探针一、标记的探针探针探针 (probe)(probe)是指是指带有标记带有标记的检测特定的基因或转的检测特定的基因或转录产物存在或表达的录产物存在或表达的DNADNA、RNARNA或寡核苷或寡核苷酸序列。酸序列。（一）探针的制备（一）探针的制备 1.1.均匀标记均匀标记 在进行探针标记是掺入标记核苷在进行探针标记是掺入标记核苷酸（如酸（如-32p -32p dATPdATP)从而使整个分从而使整个分子被均匀地标记子被均匀地标记 切口平移法标记切口平移法标记 随机引物标记随机引物标记 PCR PCR扩增标记扩增标记2

19、.2.末端标记发末端标记发将放射性或非放射活性化学基团连接到多将放射性或非放射活性化学基团连接到多聚体末端的技术聚体末端的技术多在多在55端进行端进行abcde3双链的双链的DNADNA分子分子由由DNaseDNase I I产生的单链产生的单链切口，带有切口，带有3 3-OH-OH末端末端大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I 的的 5 5-3-3外切酶活性从缺口的外切酶活性从缺口的5 5-P -P 一侧一侧移去一到数个核苷酸移去一到数个核苷酸大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I将将-3232p p dNTPdNTP参入取代原先被删除的核参入取代原先被删除的核苷酸苷酸重复重

20、复 c d c d 的步骤，使切口沿着的步骤，使切口沿着5 5-3-3方向移动，形成方向移动，形成3232p p 标记标记的合成的的合成的DNADNA链（图中以链（图中以 表示）表示）DNaseDNase I I大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I55355555533333555333切口平移法制备标记的切口平移法制备标记的DNADNA分子杂交探针分子杂交探针双链的双链的DNADNA分子分子由由DNaseDNase I I产生的单链产生的单链切口，带有切口，带有3 3-OH-OH末端末端大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I 的

21、的 5 5-3-3外切酶活性从缺口的外切酶活性从缺口的5 5-P -P 一侧一侧移去一到数个核苷酸移去一到数个核苷酸大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I将将-3232p p dNTPdNTP参入取代原先被删除的核参入取代原先被删除的核苷酸苷酸重复重复 c d c d 的步骤，使切口沿着的步骤，使切口沿着5 5-3-3方向移动，形成方向移动，形成3232p p 标记标记的合成的的合成的DNADNA链（图中以链（图中以 表示）表示）DNaseDNase I I大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I5535555553333355533

22、3二、萨瑟恩二、萨瑟恩DNADNA印迹杂交（印迹杂交（Southern blottingSouthern blotting）1.1.定义定义 根根据据毛毛细细管管作作用用的的原原理理，使使在在电电泳泳凝凝胶胶中中分分离离的的DNADNA片片段段转转移移并并结结合合在在适适当当的的滤滤膜膜上上，然然后后通通过过同同标标记记的的单单链链DNADNA或或RNARNA探探针针的的杂杂交交作作用用检检测测这这些些被被转转移移的的DNADNA片片段段，这种实验方法叫做这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由由于于它它是是由由E.E.SouthernSouthern于于19751975年年首首先先设计设计基本

23、步骤样品制备样品制备标记标记膜的制备膜的制备DNADNA杂交杂交放射自显影放射自显影探针探针 Southern DNA印迹杂交之X光显像图片水稻（Oryza sativa L.）的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl（AC）、BamH（DF）、EcoR(GI)和Hind（JL）消化，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列，相应的分子大小以kb为单位示于图的右侧）三、诺塞恩三、诺塞恩RNARNA印迹杂交印迹杂交1.1.原理：原理：将将变变性性琼琼脂脂糖糖胶胶电电泳泳分分离离的的RNARNA或或mRNAmRNA，转转移移

24、吸吸印印到到特特殊殊活活性性滤滤膜膜或或滤滤纸纸上上，与与标标记记的的探探针针杂杂交交，然然后后放放射射自自显显影影以以分分析析RNARNA（大大小小、数数量量）的的方方法法，叫叫做做诺诺塞塞恩恩RNARNA吸印杂交技术（吸印杂交技术（Northern blottingNorthern blotting）。）。19791979年年，J.J.C.C.AlwineAlwine等等人人发发展展出出的的一一种种方方法法四、菌落（或噬菌斑）杂交四、菌落（或噬菌斑）杂交四、菌落（或噬菌斑）杂交四、菌落（或噬菌斑）杂交 in situ hybridizationin situ hybridizationin situ hybridizationin situ hybridization