第二章 色谱法原理一.ppt

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1、第二章第二章 色谱法原理色谱法原理2.1 概述 色色谱谱法法早早在在19031903年年由由俄俄国国植植物物学学家家分分离离植植物物色色素素时时采采用用。他他为为了了分分离离植植物物色色素素，将将植植物物绿绿叶叶的的石石油油醚醚提提取取液液倒倒入入装装有有碳碳酸酸钙钙粉粉末末的的玻玻璃璃管管中中，并并用用石石油油醚醚自自上上而而下下淋淋洗洗，由由于于不不同同的的色色素素在在碳碳酸酸钙钙颗颗粒粒表表面面的的吸吸附附力力不不同同，随随着着淋淋洗洗的的进进行行，不不同同色色素素向向下下移移动动的的速速度度不不同同，形形成成一一圈圈圈圈不不同同颜颜色色的的色色带带，使使各各色色素素成成分分得得到到了了

2、分分离离。他他将将这这种种分分离离方方法法命命名名为为色色谱法（谱法（chromatography）。）。Michael Tswett(1872-1919),a Russian botanist,discovered the basic principles of column chromatography.He separated plant pigments by eluting a mixture of the pigments on a column of calcium carbonate.The various pigments separated into colored ban

3、ds;hence the name chromatography.l后后来来不不仅仅用用于于分分离离有有色色物物质质，还还用用于于分分离离无无色色物物质质，并并出出现现了了种种类类繁繁多多的的各各种种色色谱谱法法。但但不不管管属属于于哪哪一一类类色色谱谱法法，其其共共同同的的基基本本特特点点是是具具备备两两个个相相：不不动动的的一一相相，称称一一为为固固定定相相；另另一一相相是是携携带带样样品品流流过过固固定定相相的的流流动动体体，称称为为流流动动相相。当当流流动动相相中中样样品品混混合合物物经经过过固固定定相相时时，就就会会与与固固定定相相发发生生作作用用，由由于于各各组组分分在在性性质质和

4、和结结构构上上的的差差异异，与与固固定定相相相相互互作作用用的的类类型型、强强弱弱也也有有差差异异，因因此此在在同同一一推推动动力力的的作作用用下下，不不同同组组分分在在固固定定相相滞滞留留时时间间长长短短不不同同，从从而而按按先先后后不不同同的的次次序序从从固固定定相相中中流出。流出。在色谱发展史上占有重要地位的英国人A.J.P.A.J.P.Martin(Martin(马丁马丁)和和R.L.M.R.L.M.SyngeSynge(辛格辛格)，他们，他们提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952年，因为他们对分配色谱理论的贡献获诺贝尔化学奖。色谱法的优缺

5、点：色谱法的优缺点：分离效率高；分析速度快；检测灵敏度分离效率高；分析速度快；检测灵敏度高；样品用量少；选择性好；多组分同时分高；样品用量少；选择性好；多组分同时分析；易于自动化。析；易于自动化。定性能力较差。定性能力较差。A.J.P.MARTIN 和R.L.M.Synge A.J.P.MARTIN.(1910-2002)of the British National Institute for Medical Research shared with fellow countryman R.L.M Synge the Nobel Prize in Chemistry(1952)for the

6、 invention of partition chromatography.R.L.M.Synge born Oct.28,1914,Liverpool,Eng.died Aug.18,1994,Norwich,Norfolk.Synge studied at Winchester College,Cambridge,and received his Ph.D.at Trinity College there in 1941.2.2.2.2.色谱法的发展历史色谱法的发展历史色谱法的发展历史色谱法的发展历史年代年代发明者发明者发明的色谱方法或重要应用发明的色谱方法或重要应用1906Tswett

7、用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956Van D

8、eemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。3.色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代年代获奖学科获奖学科获奖研究工作获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学类胡萝卜

9、素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究 微观分离过程微观分离过程色谱法分类 1按两相状态分类 气气体体为为流流动动相相的的色色谱谱称称为为气气相相色色谱谱(GC）。根根据据固固定定相相是是固固体体吸吸附附剂剂还还是是固固定定液液

10、（附附着着在在惰惰性性载载体体上上的的一一薄薄层层有有机机化化合合物物液液体体），又又可可分分为为气气固固色色谱谱（GSC）和和气气液色谱液色谱(GLC）。）。液液体体为为流流动动相相的的色色谱谱称称液液相相色色谱谱（LC)。液液相相色色谱谱又又分为液固夜谱（分为液固夜谱（LSC）和液液色谱和液液色谱（LLC）。）。超超临临界界流流体体为为流流动动相相的的色色谱谱称称为为超超临临界界流流体体色色谱谱（SFC）。2.2.按分离机理分类按分离机理分类 利利利利用用用用组组组组分分分分在在在在吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂（固固固固定定定定相相相相）上上上上的的的的吸吸吸吸附附附附能能能能力力力力强强强强

11、弱弱弱弱不不不不同同同同而得以分离的方法，称为而得以分离的方法，称为而得以分离的方法，称为而得以分离的方法，称为吸附色谱吸附色谱吸附色谱吸附色谱法法法法。利利利利用用用用组组组组分分分分在在在在固固固固定定定定液液液液（固固固固定定定定相相相相）中中中中溶溶溶溶解解解解度度度度不不不不同同同同而而而而达达达达到到到到分分分分离的方法称为离的方法称为离的方法称为离的方法称为分配色谱法分配色谱法分配色谱法分配色谱法。利利利利用用用用组组组组分分分分在在在在离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂（固固固固定定定定相相相相）上上上上的的的的亲亲亲亲和和和和力力力力大大大大小小小小不不不不同而达到分离

12、的方法，称为同而达到分离的方法，称为同而达到分离的方法，称为同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法离子交换色谱法。利利利利用用用用大大大大小小小小不不不不同同同同的的的的分分分分子子子子在在在在多多多多孔孔孔孔固固固固定定定定相相相相中中中中的的的的选选选选择择择择渗渗渗渗透透透透而而而而达达达达到分离的方法，称为到分离的方法，称为到分离的方法，称为到分离的方法，称为凝胶色谱法凝胶色谱法凝胶色谱法凝胶色谱法或或或或尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法尺寸排阻色谱法。最最最最近近近近，又又又又有有有有一一一一种种种种新新新新分分分分离离离离技技技技术术术术，利利

13、利利用用用用不不不不同同同同组组组组分分分分与与与与固固固固定定定定相相相相（固固固固定定定定化化化化分分分分子子子子）的的的的高高高高专专专专属属属属性性性性亲亲亲亲和和和和力力力力进进进进行行行行分分分分离离离离的的的的技技技技术术术术称称称称为为为为亲亲亲亲和色谱法和色谱法和色谱法和色谱法，常用于蛋白质的分离，常用于蛋白质的分离，常用于蛋白质的分离，常用于蛋白质的分离 。3 3按固定相的外形分类按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法，称为固定相装于柱内的色谱法，称为固定相装于柱内的色谱法，称为固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱柱色谱柱色谱柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为固定相呈平

14、板状的色谱法，称为固定相呈平板状的色谱法，称为固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱平板色谱平板色谱平板色谱，它又可分，它又可分，它又可分，它又可分为为为为薄层色谱薄层色谱薄层色谱薄层色谱和和和和纸色谱纸色谱纸色谱纸色谱。根据以上所述，将色谱法的分类总结于表18-l中。2.2 色色谱谱流出曲流出曲线线及有关及有关术语术语一流出曲一流出曲线线和色和色谱谱峰峰 如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：式中：C不同时间t时某物质的浓度，C0进样浓度，tr保留时间，标准偏差。二、基线 是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图183中

15、Ot线稳定的基线应该是一条水平直线.基线漂移 指基线随时间定向的缓慢变化。基线噪音 指由各种因素所引起的基线起伏。三、峰高三、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图183中BA 四、保留值1死时间死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图183中 OA。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用往长L与tM的比值计算。试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图183 OB它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间 2 2保留时间保留时间t tR R

16、3调整保留时间调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即 tR=tR-tM 由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR实际上是组份在固定相中停留的总时间保留时间可用时间单位（如s）或距离单位（如cm）表示。保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定 4 4死体积死体积 V VM M 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由

17、死时间与流动相体积流速F0（Lmin）计算：VM=tMF0 5保留体积保留体积 VR 指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间t。的关系如下：VR=tRF0 6调整保留体积调整保留体积VR 某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即 VR=VR-VM 7相对保留值相对保留值2.1 某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值：由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之

18、比.8.8.选择因子选择因子 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值此时，ri/s可能大于1，也可能小于1在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数在这种特殊情况下，可用符号表示：式中tR2为后出峰的调整保留时间，所以这时总是大于1的。色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：1.标准偏差标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图183中EF距离的一半。2.半峰宽半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽，如图183中GH间的距离它

19、与标准偏差的关系是：W1/2=2.354五、区域宽度 即即色色谱谱峰峰两两侧侧拐拐点点上上的的切切线线在在基基线线上上的的截截距距，如图中如图中IJIJ的距离它与标准偏差。的关系是：的距离它与标准偏差。的关系是：W=4 3.3.峰底宽度峰底宽度W W 从色谱流出曲线上，得到信息是：（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数 （2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析 (3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析 （4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据 （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据 2.3 2.3 色谱法分

20、析的基本原理色谱法分析的基本原理 色色谱谱分分析析的的目目的的是是将将样样品品中中各各组组分分彼彼此此要要达达到到完完全全分分离离，两两峰峰间间的的距距离离必必须须足足够够远远，两两两两峰峰峰峰间间间间的的的的距距距距离离离离是是是是由由由由组组组组分分分分在在在在两两两两相相相相间间间间的的的的分分分分配配配配系系系系数数数数决决决决定定定定的的的的，即即即即与与与与色色色色谱谱谱谱过过过过程程程程的的的的热热热热力力力力学学学学性性性性质质质质有有有有关关关关。但但是是两两峰峰间间虽虽有有一一定定距距离离，如如果果每每个个峰峰都都很很宽宽，以以致致彼彼此此重重叠叠，还还是是不不能能分分开开

21、。这这这这些些些些峰峰峰峰的的的的宽宽宽宽或或或或窄窄窄窄是是是是由由由由组组组组分分分分在在在在色色色色谱谱谱谱柱柱柱柱中中中中传传传传质质质质和和和和扩扩扩扩散散散散行行行行为为为为决决决决定定定定的的的的，即即即即与与与与色色色色谱谱谱谱过过过过程程程程的的的的动动动动力力力力学学学学性性性性质质质质有有有有关关关关。因因此此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。一、分配系数K和分配比k1分配系数分配系数K 如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，吸在固定相和流动相之间

22、反复多次地分配过程，吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数见它描述，而描述这种分配的参数称为分配系数见它是指在一定温度和压力下，是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值相之间分配达平衡时的浓度之比值，即，即 2.分配比分配比k 分配比又称容量因子容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 k值越大，说明组分在固定相中的量

23、越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。式中CS，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度；Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。滞留因子Rs 分配比k值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以usu此两速度之比称为滞留因子Rs。Rs若

24、用质量分数表示，即 对对组组分分和和流流动动相相通通过过长长度度为为L L的的色色谱谱柱柱，其其所所需时间分别为需时间分别为整理公式，可得 3.3.分配系数分配系数K K与分配比与分配比k k的关系的关系 其中称为相比率，它是反映各种色谱柱型及结构特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为635；对毛细管柱，其值为60600。4分配系数分配系数K K及分配比及分配比k k与与 选择因子选择因子的关系的关系 根据对以上公式处理，对A、B两组分的选择因子，可用下式表示 上式表明：通通过过选选择择因因子子把把实实验验测测量量值值k与与热热力力学学性性质质的的分分配配系系数数K直直接接联联系系起起来

25、来，对对固固定定相相的的选选择择具具有有实实际际意意义义。如如果果两两组组分分的的K或或k值值相相等等，则则=1，两两个个组组分分的的色色谱谱峰峰必必将将重重合合，说说明明分分不不开开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。最最早早由由Martin等等人人提提出出塔塔板板理理论论，把把色色谱谱柱柱比比作作一一个个精精馏馏塔塔，沿沿用用精精馏馏塔塔中中塔塔板板的的概概念念来来描描述述组组分分在在两两相相间间的的分分配配行行为为，同同时时引引人人理理论论塔塔板板数数作作为为衡衡量量柱柱效效率率的的指指标。标。二二 塔板理论塔板理论（plate t

26、heory）该该理理论论假定：假定：（i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。（ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。（iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。（iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一 塔板上的量无关。为简单起见，设色谱往由5块塔板（n5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r=1，2，nl；某组分的分配比k=1.根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1g）的该组分

27、加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ms=mm故mm=ms=0.5。当一个板体积（lV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有mm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ms部分组分及1号板气相中的mm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0.5，其中气液（或气固）两相各为0.25而1号板上所含总量同样为0.5气液（或气固）相亦各为0.25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。按上述分配过程，对于按上述分配过程，对于n=5n=5，k=1k=1，m=1m=1的体系，随的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加

28、，组分分布在柱内任一着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气液两相中的总质量）板上的总量（气液两相中的总质量）,由塔板理论可建流由塔板理论可建流出曲线方程：出曲线方程：m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。当流动相体积V=Vr 时，C值最大，即 色谱柱长：色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：则三者的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为：理论塔板数与色谱参数之间的关系为：从从上上两两式式可可以以看看出出，色色谱谱峰峰W越越小小，n就就越越大大，而而H就就越越小小，柱柱效效能能越越高高

29、。因因此此，n和和H是描述柱效能的指是描述柱效能的指标标。通通常常填填充充色色谱谱柱柱的的n103，H1mm。而而毛毛细细管柱管柱 n=105-106，H0.5mm。由于死由于死时时tM包括在包括在tR中，而中，而实际实际的的tM不参不参与柱内分配，所与柱内分配，所计计算的算的n值值尽大，尽大，H很小很小,但与但与实际实际柱效能相差甚柱效能相差甚远远。所以，提出把。所以，提出把tM扣除，扣除，采用采用有效理有效理有效理有效理论论论论塔板数塔板数塔板数塔板数n neffeff和有效塔板高和有效塔板高和有效塔板高和有效塔板高HHeffeff评评评评价价价价柱效能。柱效能。柱效能。柱效能。塔塔板板理

30、理论论用用热热力力学学观观点点形形象象地地描描述述了了溶溶质质在在色色谱谱柱柱中中的的分分配配平平衡衡和和分分离离过过程程，导导出出流流出出曲曲线线的的数数学学模模型型，并并成成功功地地解解释释了了流流出出曲曲线线的的形形状状及及浓浓度度极极大大值值的的位位置置，还还提提出出了了计计算算和和评评价价柱柱效效的的参参数数。但但由由于于它它的的某某些些基基本本假假设设并并不不完完全全符符合合柱柱内内实实际际发发生生的的分分离离过过程程，例例如如，纵纵向向扩扩能能解解释释造造成成谱谱带带扩扩张张的的原原因因和和影影响响板板高高的的各各种种因因素素，也也不不能能说说明明为为什什么么在在不不同同流流速速

31、下下可可以以测测得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用。得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用。塔板理论的特点和不足塔板理论的特点和不足 (1)当当色色谱谱柱柱长长度度一一定定时时，塔塔板板数数 n 越越大大(塔塔板板高高度度 H 越越小小)，被被测测组组分分在在柱柱内内被被分分配配的的次次数数越越多多，柱柱效效能能则则越越高高，所所得色谱峰越窄。得色谱峰越窄。(2)(2)不不同同物物质质在在同同一一色色谱谱柱柱上上的的分分配配系系数数不不同同，用用有有效效塔塔板板数数和和有有效效塔塔板板高高度度作作为为衡衡量量柱柱效效能能的的指指标标时时，应应指指明明测测定定物物质。质。(3)(3)柱柱效效不不能能表表示示被被分分离离组组分分的的实实际际分分离离效效果果，当当两两组组分分的的分分配配系系数数K K相相同同时时，无无论论该该色色谱谱柱柱的的塔塔板板数数多多大大，都都无无法法分分离。离。(4)(4)塔塔板板理理论论无无法法解解释释同同一一色色谱谱柱柱在在不不同同的的载载气气流流速速下下柱柱效效不不同同的的实实验验结结果果，也也无无法法指指出出影影响响柱柱效效的的因因素素及及提提高高柱柱效效的途径。的途径。