蛋白质不稳定性.ppt

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1、第二章第二章 蛋白质的不稳定性及对策蛋白质的不稳定性及对策 刘耀玺刘耀玺河南科技大学林业职业学院河南科技大学林业职业学院河南科技大学林业职业学院河南科技大学林业职业学院生物技术教研室生物技术教研室生物技术教研室生物技术教研室一、蛋白质失活的机制一、蛋白质失活的机制 根根据据蛋蛋白白质质的的结结构构层层次次不不同同，经经常常将将蛋蛋白白质质的的结结构构分分为为一一级级结结构构、二二级级结结构构、三三级级结结构构和和四四级结构。级结构。蛋蛋白白质质的的一一级级结结构构就就是是共共价价主主链链的的氨氨基基酸酸序序列列，有有时时也也称称化化学学结结构构。二二、三三、四四级级结结构构又又称称空间结构（即

2、三维结构）或高级结构。空间结构（即三维结构）或高级结构。蛋蛋白白质质的的生生物物功功能能决决定定于于它它的的高高级级结结构构，高高级级结结构构是是由由一一级级结结构构即即氨氨基基酸酸序序列列决决定定的的。而而氨氨基基酸酸序序列列是是由由遗遗传传物物质质DNADNA的的核核苷苷酸酸序序列列决决定定的的。肽肽键键（CO-NHCO-NH）是是连连接接多多肽肽链链主主链链中中氨氨基基酸酸残残基基的的共共价价键键，二二硫硫键键（-S-S-S-S-）是是使使多多肽肽链链之之间间交交联或使多肽链内成环的共价键。联或使多肽链内成环的共价键。一、蛋白质失活的机制一、蛋白质失活的机制p蛋白质不稳定（失活）的表现分

3、为两种，蛋白质不稳定（失活）的表现分为两种，即化学不即化学不稳定和物理不稳定。稳定和物理不稳定。p化学不稳定化学不稳定是指蛋白质分子通过共价键的形成和断是指蛋白质分子通过共价键的形成和断裂形成新的化学实体；裂形成新的化学实体；p物理不稳定物理不稳定指蛋白质分子的高级结构的物理转变，指蛋白质分子的高级结构的物理转变，无共价键改变。无共价键改变。物理不稳定包括变性、聚集、沉淀物理不稳定包括变性、聚集、沉淀和表面吸附。和表面吸附。p蛋白质一旦发生了化学不稳定，就会完全丧失其原蛋白质一旦发生了化学不稳定，就会完全丧失其原有生理活性，产生新的功能活性或完全丧失生物活有生理活性，产生新的功能活性或完全丧失

4、生物活性。但性。但物理不稳定现象一般可以通过特定的途径恢物理不稳定现象一般可以通过特定的途径恢复其空间结构，而恢复原有的活性，复其空间结构，而恢复原有的活性，我们称这一过我们称这一过程为蛋白质的复性。程为蛋白质的复性。二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 p蛋白质的天然折叠结构决定于蛋白质的天然折叠结构决定于3 3个因素：个因素：1 1、与溶剂分子（一般为水）的相互作用；、与溶剂分子（一般为水）的相互作用；2 2、溶剂的、溶剂的pHpH和离子组成；和离子组成；3 3、蛋白质的氨基酸序列。、蛋白质的氨基酸序列。前两个因素的影响明确、易理解，而氨基酸序前两个因素

5、的影响明确、易理解，而氨基酸序列的作用则不那么直觉。实际上列的作用则不那么直觉。实际上,一级结构便于序一级结构便于序列上相邻部分之间短程相互作用的形成，也便于相列上相邻部分之间短程相互作用的形成，也便于相隔部分之间长程相互作用的出现，隔部分之间长程相互作用的出现，虽然蛋白质分子虽然蛋白质分子的整个结构出看起来像是无组织的随机排列，然而的整个结构出看起来像是无组织的随机排列，然而其结构中无例外地其结构中无例外地有多种力处于精细的平衡之中有多种力处于精细的平衡之中，正是它决定了蛋白质的独特构象。正是它决定了蛋白质的独特构象。二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素p

6、稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一些稳定蛋白质三维结构的作用力主要是一些所谓的所谓的弱的相互作用弱的相互作用或称或称非共价键非共价键或或次级次级键键，包括：，包括：氢键、范德华力、疏水作用和氢键、范德华力、疏水作用和盐键（离子键）。盐键（离子键）。此外，此外，共价二硫键共价二硫键在稳在稳定某些蛋白质的构象方面也起着重要作用。定某些蛋白质的构象方面也起着重要作用。p这几种作用力的键能（断裂该键所需的能这几种作用力的键能（断裂该键所需的能量）都是较低的。量）都是较低的。二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素p氢键氢键 13-30KJ/mol13-30KJ/mol-

7、1-1p范德华力范德华力 4-8 KJ/mol4-8 KJ/mol-1-1 p疏水作用疏水作用 12-20 KJ/mol12-20 KJ/mol-1-1 （注意：疏水作用的（注意：疏水作用的数值表示在数值表示在2525非极性侧链能够从蛋白质内部转非极性侧链能够从蛋白质内部转移到水介质中所需的自由能，它与其他键的键能移到水介质中所需的自由能，它与其他键的键能不同，此数值在一定范围内随温度的升高而增加。不同，此数值在一定范围内随温度的升高而增加。实际上它并不是键能，此能量的大部分并不用于实际上它并不是键能，此能量的大部分并不用于伸展过程中键的断裂。）伸展过程中键的断裂。）p盐键盐键 12-30 K

8、J/mol-112-30 KJ/mol-1p二硫键二硫键 210 KJ/mol-1210 KJ/mol-1二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素p（一）氢键：（一）氢键：氢键在稳定蛋白质的结构中起着极其重要的氢键在稳定蛋白质的结构中起着极其重要的作用，作用，多肽主链上的羰基和酰胺基之间多肽主链上的羰基和酰胺基之间形成的氢形成的氢键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力，另外，键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力，另外，氢键还可以在氢键还可以在侧链与侧链侧链与侧链、侧链与介质水侧链与介质水、主链主链肽基与侧链肽基与侧链或或主链肽基与水主链肽基与水之间形成。之间形成。大多

9、数蛋白质分子所采取的折叠策略是使主大多数蛋白质分子所采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如链肽基之间形成最大数目的分子内氢键（如螺螺旋、旋、折叠），与此同时保持大多数能成氢键的折叠），与此同时保持大多数能成氢键的侧链处于蛋白质分子的表面将与水结合。侧链处于蛋白质分子的表面将与水结合。二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素p（二）范德华力（范德华相互作用）：（二）范德华力（范德华相互作用）：p广义的范德华力包括广义的范德华力包括3 3种较弱的作用力，即：种较弱的作用力，即：定向效应：定向效应：发生在极性分子或极性基团之间，它是永发生在极性分子

10、或极性基团之间，它是永久偶极间的静电相互作用，氢键可被认为属于这种范久偶极间的静电相互作用，氢键可被认为属于这种范德华力；德华力；诱导效应：诱导效应：发生在极性物质与非极性物质之间，这是发生在极性物质与非极性物质之间，这是永久性偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的静电相永久性偶极与由它诱导而来的诱导偶极之间的静电相互作用；互作用；分散效应：分散效应：是在多数情况下起主要作用的范德华力，是在多数情况下起主要作用的范德华力，它是非极性分子或基团间仅有的一种范德华力，即狭它是非极性分子或基团间仅有的一种范德华力，即狭义的范德华力，通常所说的范德华力指的就是这种作义的范德华力，通常所说的范德华力指的就是

11、这种作用力。它是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时用力。它是瞬时偶极间的相互作用，偶极方向是瞬时变化的。变化的。二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素 瞬时偶极是由于所在分子或基团中电子电荷密度瞬时偶极是由于所在分子或基团中电子电荷密度的波动，即电子运动的不对称性造成的。瞬时偶极可的波动，即电子运动的不对称性造成的。瞬时偶极可以诱导周围的分子或基团产生诱导偶极，诱导偶极反以诱导周围的分子或基团产生诱导偶极，诱导偶极反过来又稳定了原来的偶极，因此它们之间产生了相互过来又稳定了原来的偶极，因此它们之间产生了相互作用。作用。狭义的范德华力是一种很弱的作用力，而且随

12、狭义的范德华力是一种很弱的作用力，而且随非共价键合原子与分子间距离（非共价键合原子与分子间距离（R R）的）的6 6次方的倒数而次方的倒数而变化。变化。虽然就个别来说，范德华力是很弱的，但是范虽然就个别来说，范德华力是很弱的，但是范德华相互作用数量大，并且具有加和效应和位相效应德华相互作用数量大，并且具有加和效应和位相效应（当分子或集团相同时，其瞬间偶极矩同位相，从而（当分子或集团相同时，其瞬间偶极矩同位相，从而产生最大的相互作用），因此，就成为一种不可忽视产生最大的相互作用），因此，就成为一种不可忽视的作用力。的作用力。二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素

13、（三）疏水作用：（三）疏水作用：p水介质中球状蛋白质的折叠总是趋向于把疏水残基埋藏在水介质中球状蛋白质的折叠总是趋向于把疏水残基埋藏在分子的内部，这一现象称为疏水作用或疏水效应。它在稳分子的内部，这一现象称为疏水作用或疏水效应。它在稳定蛋白质的三级结构方面占有突出地位。定蛋白质的三级结构方面占有突出地位。疏水作用其实并疏水作用其实并不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团或不是疏水基团之间有什么吸引力的缘故，而是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。当然，当疏水基当然，当疏水基团接近到等于范德华距离时，相互间将有弱的范德华引力，团接近到等于范

14、德华距离时，相互间将有弱的范德华引力，但这不是主要的。蛋白质溶液中的熵增加是疏水作用的主但这不是主要的。蛋白质溶液中的熵增加是疏水作用的主要动力。要动力。p疏水作用在生理温度范围内随温度升高而加强，疏水作用在生理温度范围内随温度升高而加强，但超过一但超过一定温度后（定温度后（50-6050-60，因侧链而异），又趋减弱，因为超，因侧链而异），又趋减弱，因为超过这个温度，疏水基团周围的水分子有序度降低，因而有过这个温度，疏水基团周围的水分子有序度降低，因而有利于疏水基团进入水中。利于疏水基团进入水中。p非极性溶剂、去污剂是破坏疏水作用的试剂，因此是非极性溶剂、去污剂是破坏疏水作用的试剂，因此是变

15、性变性剂剂。尿素和盐酸胍既能破坏氢键，又能破坏疏水作用，因。尿素和盐酸胍既能破坏氢键，又能破坏疏水作用，因此是此是强变性剂强变性剂。二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素p（四）盐键：（四）盐键：又称盐桥或离子键。它是正电荷与负电荷之间的一种静电又称盐桥或离子键。它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。在生理相互作用。在生理pHpH下下,蛋白质中的酸性氨基酸（天冬氨酸蛋白质中的酸性氨基酸（天冬氨酸和谷氨酸）的侧链可离解成负离子，碱性氨基酸（赖氨酸、和谷氨酸）的侧链可离解成负离子，碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸和组氨酸）的侧链可离解成正离子。精氨酸和组氨酸）的侧链

16、可离解成正离子。在多数情况下在多数情况下这些基团都分布在球状蛋白质分子表面，而与介质水分子这些基团都分布在球状蛋白质分子表面，而与介质水分子发生电荷发生电荷-偶极之间的相互作用，偶极之间的相互作用，形成排列有序的形成排列有序的水化层水化层，这对稳定蛋白质的构象有着一定作用。这对稳定蛋白质的构象有着一定作用。p带电荷的侧链也在蛋白质分子内部出现，它们一般与其他带电荷的侧链也在蛋白质分子内部出现，它们一般与其他基团形成强的氢键，但是偶尔也有少数带相反电荷的侧链基团形成强的氢键，但是偶尔也有少数带相反电荷的侧链在分子的疏水作用内部形成盐键。在分子的疏水作用内部形成盐键。在疏水环境中，介电常在疏水环境

17、中，介电常数比在水中低，相反电荷间的吸引力相应增大。当荷电侧数比在水中低，相反电荷间的吸引力相应增大。当荷电侧链从水中转移到分子内部时，它周围有序排列的水分子被链从水中转移到分子内部时，它周围有序排列的水分子被释放到介质水中，因此，盐键的形成不仅是静电吸引而且释放到介质水中，因此，盐键的形成不仅是静电吸引而且也是熵增加的过程。也是熵增加的过程。升高温度，可以增加盐桥的稳定性。升高温度，可以增加盐桥的稳定性。此外，盐键因加入非极性溶剂而加强，加入盐类而减弱。此外，盐键因加入非极性溶剂而加强，加入盐类而减弱。二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素二、蛋白质结构中影响稳定性的重要因素p（五）二硫键：（

18、五）二硫键：二硫键的形成并不规定多肽链的折叠。二硫键的形成并不规定多肽链的折叠。然而一旦蛋白质采取了它的三维结构，则然而一旦蛋白质采取了它的三维结构，则二硫键的形成将对此构象起稳定作用。二硫键的形成将对此构象起稳定作用。同同一个蛋白质中，有些二硫键是生物活性所一个蛋白质中，有些二硫键是生物活性所必需的，另一些二硫键则不是生物活性所必需的，另一些二硫键则不是生物活性所必需的，但与维持蛋白质的稳定有关，必需的，但与维持蛋白质的稳定有关，假假如蛋白质中所有的二硫键相继被还原，将如蛋白质中所有的二硫键相继被还原，将引起蛋白质的天然构象改变和生物活性丢引起蛋白质的天然构象改变和生物活性丢失。失。三、环境

19、因素对蛋白质稳定性的影响三、环境因素对蛋白质稳定性的影响p物理因素物理因素：温度、紫外线照射、高压和表面张：温度、紫外线照射、高压和表面张力等；力等；p化学因素化学因素：有机溶剂、脲、胍、酸、碱等；如：有机溶剂、脲、胍、酸、碱等；如尿素和盐酸胍，一方面能与多肽主链竞争氢键，尿素和盐酸胍，一方面能与多肽主链竞争氢键，破坏蛋白质的二级结构；更重要的是它们可以破坏蛋白质的二级结构；更重要的是它们可以增加非极性侧链在水中的溶解度，因而降低了增加非极性侧链在水中的溶解度，因而降低了维持蛋白质三级结构的疏水相互作用。维持蛋白质三级结构的疏水相互作用。p酶的作用酶的作用：一些蛋白质分解酶类的作用。：一些蛋白

20、质分解酶类的作用。p微生物因素微生物因素：微生物分解利用蛋白质进行生长：微生物分解利用蛋白质进行生长繁殖繁殖 三、环境因素对蛋白质稳定性的影响三、环境因素对蛋白质稳定性的影响p值得注意的是：值得注意的是：蛋白质的变性是一个蛋白质的变性是一个协同协同过程，过程，它是在所加变性剂的很窄浓度范围它是在所加变性剂的很窄浓度范围内或很窄内或很窄pHpH或温度间隔内突然发生的。或温度间隔内突然发生的。四、分离纯化中保持蛋白质稳定的方法四、分离纯化中保持蛋白质稳定的方法 1 1、尽量在相对密封和无菌的环境下、尽量在相对密封和无菌的环境下快速快速进行进行分离纯化操作；分离纯化操作；2 2、在生理温度和压力范围

21、内完成分离纯化操、在生理温度和压力范围内完成分离纯化操作；作；3 3、慎用溶剂和酸、碱、盐类，使用前要进行、慎用溶剂和酸、碱、盐类，使用前要进行详细的试验，详细的试验，确定最佳添加量和条件确定最佳添加量和条件；4 4、钝化或抑制蛋白质分解酶类的活性；、钝化或抑制蛋白质分解酶类的活性；5 5、选择合适分离方法。如：凝胶过滤、离子、选择合适分离方法。如：凝胶过滤、离子交换、吸附层析、亲和层析、电泳、结晶等。交换、吸附层析、亲和层析、电泳、结晶等。五、包含体的形成与性质五、包含体的形成与性质 p重组蛋白质的过量表达常常导致其在胞内发生错重组蛋白质的过量表达常常导致其在胞内发生错误折叠和聚集，误折叠和

22、聚集，形成被称为包含体的集聚体。形成被称为包含体的集聚体。p包含体主要是由蛋白质构成，其中大部分是基因包含体主要是由蛋白质构成，其中大部分是基因表达产物。这些基因表达产物的一级结构是正确表达产物。这些基因表达产物的一级结构是正确的，但的，但立体结构是错误的，所以没有生理活性立体结构是错误的，所以没有生理活性。p对于以包含体形式表达的蛋白质，需要在分离回对于以包含体形式表达的蛋白质，需要在分离回收包含体后，溶解包含体使其肽链伸展，然后在收包含体后，溶解包含体使其肽链伸展，然后在合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和合适的溶液环境下使目标蛋白质恢复天然构型和生物活性，这一过程称为生物活性，这一

23、过程称为蛋白质的体外再折叠或蛋白质的体外再折叠或复性复性。五、包含体的形成与性质五、包含体的形成与性质(一一)包含体的形成包含体的形成 目前，关于包含体的形成机理尚不完全目前，关于包含体的形成机理尚不完全清楚，一般认为包含体的形成是清楚，一般认为包含体的形成是部分折叠的部分折叠的中间态之间疏水性相互作用的结果。中间态之间疏水性相互作用的结果。主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉主要原因是蛋白质本身具有易于聚集沉淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如淀的性质，或表达产物周围的物理环境（如温度、离子组成）不适或某些折叠辅助因子温度、离子组成）不适或某些折叠辅助因子（分子伴侣）的作用。（分子伴侣）的作

24、用。五、包含体的形成与性质五、包含体的形成与性质p现代研究表明：在大多数情况下，现代研究表明：在大多数情况下，包含体包含体的形成是的形成是蛋白质过量表达蛋白质过量表达的结果，而与蛋的结果，而与蛋白质的种类和表达系统无关，白质的种类和表达系统无关，即包含体的即包含体的形成与其相对分子质量、疏水性以及折叠形成与其相对分子质量、疏水性以及折叠途径等内在性质没有必然的联系。换句话途径等内在性质没有必然的联系。换句话说，对于任何蛋白质和任何表达系统，在说，对于任何蛋白质和任何表达系统，在过量表达的情况下都可能形成包含体。过量表达的情况下都可能形成包含体。p蛋白质的折叠复性和包含体的形成为蛋白质的折叠复性

25、和包含体的形成为动力动力学竞争学竞争的结果。的结果。五、包含体的形成与性质五、包含体的形成与性质 U ki I kr NU ki I kr N ka ka A A其中：其中：U U为伸展肽链；为伸展肽链；I I为折叠过程的中间态；为折叠过程的中间态；N N为天为天然活性态；然活性态；A A为聚集体（包含体），为聚集体（包含体），kiki、krkr、kaka分分别为中间体生成速率常数、折叠速率常数和聚集体别为中间体生成速率常数、折叠速率常数和聚集体生成速率常数。生成速率常数。活性产物活性产物N N的形成为分子内折叠反应，折叠速的形成为分子内折叠反应，折叠速率与浓度成正比；聚集体率与浓度成正比；聚

26、集体A A的形成反应在分子间发的形成反应在分子间发生，生，反应速率与浓度的高次方成正比，即反应级数反应速率与浓度的高次方成正比，即反应级数2 2。因此，如果新生肽浓度增加和中间态的疏水因此，如果新生肽浓度增加和中间态的疏水相互作用就可能导致包含体的形成。相互作用就可能导致包含体的形成。五、包含体的形成与性质五、包含体的形成与性质p上述分析表明，包含体的形成是不可预测上述分析表明，包含体的形成是不可预测的，取决于的，取决于系统的表达速度和浓度系统的表达速度和浓度。但当。但当含有二硫键的蛋白质在细菌的胞液中表达含有二硫键的蛋白质在细菌的胞液中表达时，时，由于胞液为还原性，巯基间不能被氧由于胞液为还

27、原性，巯基间不能被氧化形成二硫键而导致错误折叠，化形成二硫键而导致错误折叠，必然会形必然会形成包含体。成包含体。五、包含体的形成与性质五、包含体的形成与性质p（二）包含体形成的利与弊（二）包含体形成的利与弊 胞内重组蛋白质包含体的沉积可能是胞内重组蛋白质包含体的沉积可能是“天堂天堂”，也可能是，也可能是“地狱地狱”。至于是。至于是“天堂天堂”还是还是“地地狱狱”，主要取决于，主要取决于沉积的包含体蛋白质是否容易沉积的包含体蛋白质是否容易复性复性。p1 1、包含体的体内抑制、包含体的体内抑制p对于那些难于复性的蛋白质（如相对分子量较大、对于那些难于复性的蛋白质（如相对分子量较大、结构复杂和含有较

28、多二硫键的蛋白质），包含体结构复杂和含有较多二硫键的蛋白质），包含体的形成意味着表达系统的失败，的形成意味着表达系统的失败，必须着力于胞内必须着力于胞内可溶性蛋白质表达的研究，避免包含体的形成，可溶性蛋白质表达的研究，避免包含体的形成，提高可溶性蛋白质的表达量，即包含体的体内抑提高可溶性蛋白质的表达量，即包含体的体内抑制，制，主要方法有：主要方法有：五、包含体的形成与性质五、包含体的形成与性质 （1 1）降低细胞培养温度，减缓蛋白质的表达）降低细胞培养温度，减缓蛋白质的表达速度和降低表达量；速度和降低表达量；（2 2）将目标蛋白质与分子伴侣蛋白、折叠酶）将目标蛋白质与分子伴侣蛋白、折叠酶和二硫

29、键异构酶共表达，弥补外源蛋白质表达过和二硫键异构酶共表达，弥补外源蛋白质表达过程中缺乏的辅助因子；程中缺乏的辅助因子；（3 3）使用非代谢性碳源，降低代谢速度和蛋）使用非代谢性碳源，降低代谢速度和蛋白质表达量；白质表达量；(4)(4)将目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表达，将目标蛋白质与亲水性蛋白质融合表达，常用的融合蛋白质有常用的融合蛋白质有谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结谷胱甘肽转移酶、麦芽糖结合蛋白和硫氧还原蛋白。合蛋白和硫氧还原蛋白。五、包含体的形成与性质五、包含体的形成与性质 2 2以包含体形式表达重组蛋白质的优势以包含体形式表达重组蛋白质的优势 （1 1）包含体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿）包含

30、体蛋白质主要在以大肠杆菌为宿主细胞的原核细胞表达系统中形成，而大肠主细胞的原核细胞表达系统中形成，而大肠杆菌生长速度快，易于高密度培养，有利于杆菌生长速度快，易于高密度培养，有利于大规模生产目标蛋白质；大规模生产目标蛋白质；（2 2）包含体是在过量表达的情况下形成的，）包含体是在过量表达的情况下形成的，因此一般包含体蛋白质的表达量都很高；因此一般包含体蛋白质的表达量都很高；（3 3）包含体富含目的基因表达产物，有利）包含体富含目的基因表达产物，有利于后续的分离纯化。在适宜的包含体提取和于后续的分离纯化。在适宜的包含体提取和纯化条件下，目标产物纯度可达纯化条件下，目标产物纯度可达90%90%以上

31、；以上；以包含体形式表达重组蛋白质的优势以包含体形式表达重组蛋白质的优势 （4 4）沉积于包含体内的目标蛋白质不）沉积于包含体内的目标蛋白质不易被蛋白酶水解；易被蛋白酶水解；（5 5）对于那些对宿主细胞有毒害作用）对于那些对宿主细胞有毒害作用或杀伤作用的目的基因表达产物，以包含或杀伤作用的目的基因表达产物，以包含体形式表达是最可取的生产途径。体形式表达是最可取的生产途径。五、包含体的形成与性质五、包含体的形成与性质（二）包含体的性质（二）包含体的性质 1 1、包含体为高密度蛋白质聚集体，、包含体为高密度蛋白质聚集体，密度密度约约1.3g/ml.1.3g/ml.颗粒尺寸约颗粒尺寸约0.1-1.0

32、 m0.1-1.0 m,有些有些达达3m3m，对表达产物和表达系统而异。，对表达产物和表达系统而异。2 2、包含体通常位于细胞质中，而一些分、包含体通常位于细胞质中，而一些分泌性蛋白质可能在外周胞质中形成。泌性蛋白质可能在外周胞质中形成。3 3、包含体的主要成分为基因表达产物，、包含体的主要成分为基因表达产物，占包含体的占包含体的50%50%以上，其他成分因表达系统以上，其他成分因表达系统而异，包括磷脂、微量的质粒、而异，包括磷脂、微量的质粒、rRNArRNA和和RNARNA聚合酶，更多的是黏附于包含体颗粒的外聚合酶，更多的是黏附于包含体颗粒的外膜蛋白质。膜蛋白质。六、包含体的分离纯化与溶解六

33、、包含体的分离纯化与溶解 p1 1、包含体的分离、包含体的分离 包含体分离的最常用的方法就是：机械包含体分离的最常用的方法就是：机械破碎后进行离心沉降和膜分离（洗滤）。破碎后进行离心沉降和膜分离（洗滤）。包含体为致密的蛋白质聚集体，密度较包含体为致密的蛋白质聚集体，密度较大，达大，达1.3g/ml1.3g/ml，高强度的机械破碎后，低，高强度的机械破碎后，低速离心便可沉淀，从而使之与细胞碎片和速离心便可沉淀，从而使之与细胞碎片和可溶性产物分离。可溶性产物分离。六、包含体的分离纯化与溶解六、包含体的分离纯化与溶解p2 2、包含体的纯化、包含体的纯化p原因原因：蛋白质的折叠复性和包含体的形成为：蛋

34、白质的折叠复性和包含体的形成为动动力学竞争力学竞争的结果。也就是说，蛋白质的复性是的结果。也就是说，蛋白质的复性是分子内折叠和分子间聚集反应的竞争动力学过分子内折叠和分子间聚集反应的竞争动力学过程。因此，程。因此，为了提高蛋白质的复性收率，必须为了提高蛋白质的复性收率，必须抑制聚集体的生成，促进复性反应向正确折叠抑制聚集体的生成，促进复性反应向正确折叠的方向进行。的方向进行。研究表明：在质粒研究表明：在质粒DNADNA、脂多糖和、脂多糖和其他蛋白质存在时，蛋白质的聚集体生成速率其他蛋白质存在时，蛋白质的聚集体生成速率增大，复性收率降低，而纯化的变性增大，复性收率降低，而纯化的变性/还原蛋白还原

35、蛋白质的复性收率可以得到大幅度的提高。因此，质的复性收率可以得到大幅度的提高。因此，包含体的纯度对复性收率影响显著，为了实现包含体的纯度对复性收率影响显著，为了实现较高的蛋白质复性收率，必须进行包含体的纯较高的蛋白质复性收率，必须进行包含体的纯化。化。六、包含体的分离纯化与溶解六、包含体的分离纯化与溶解p方法：方法：包含体的纯化过程因表达系统和表包含体的纯化过程因表达系统和表达产物而异，达产物而异，没有通用的最佳方案。因此，没有通用的最佳方案。因此，对于特定的表达系统和表达产物，需要根对于特定的表达系统和表达产物，需要根据具体情况进行过程开发试验，确定适宜据具体情况进行过程开发试验，确定适宜的

36、纯化方案。的纯化方案。经常采用的包含体分离纯化经常采用的包含体分离纯化过程包括差速离心和反复洗涤步骤，以最过程包括差速离心和反复洗涤步骤，以最大限度地清除难以去除的膜蛋白质大限度地清除难以去除的膜蛋白质。p可参考的一般过程如下：可参考的一般过程如下：六、包含体的分离纯化与溶解六、包含体的分离纯化与溶解p路线路线1 1：p细胞破碎。细胞破碎。为提高下一步的离心分离效率，为提高下一步的离心分离效率，需进行高强度的破碎（利用高压匀浆破碎时需需进行高强度的破碎（利用高压匀浆破碎时需反复操作多次）。反复操作多次）。p离心沉降回收包含体。离心沉降回收包含体。在较高的离心机转数在较高的离心机转数（离心力）下

37、除去可溶性组分和沉降速度较小（离心力）下除去可溶性组分和沉降速度较小的细胞碎片，回收沉降的粗包含体。的细胞碎片，回收沉降的粗包含体。p粗包含体的洗涤。粗包含体的洗涤。向粗包含体中加入鳌合剂向粗包含体中加入鳌合剂EDTA(EDTA(乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸)和低浓度变性剂（如和低浓度变性剂（如1-1-4mol/L4mol/L尿素，或尿素，或1 1一一2mol/L2mol/L盐酸胍）或表面活性盐酸胍）或表面活性剂（如剂（如1-20g/L Triton X-1001-20g/L Triton X-100聚氧乙烯烷基酚聚氧乙烯烷基酚),溶解吸附在包含体表面的磷脂和膜蛋白质。同溶解吸附在包含体表面的磷脂

38、和膜蛋白质。同时加入一定浓度的蔗糖，提高包含体悬浮液的时加入一定浓度的蔗糖，提高包含体悬浮液的密度。密度。六、包含体的分离纯化与溶解六、包含体的分离纯化与溶解p离心沉降回收包含体。离心沉降回收包含体。在较低的转数下在较低的转数下离心分离，回收沉降的包含体。离心分离，回收沉降的包含体。p根据需要，可重复上述步骤根据需要，可重复上述步骤和和，直，直至达到满意的包含体纯度。至达到满意的包含体纯度。六、包含体的分离纯化与溶解六、包含体的分离纯化与溶解p细胞破碎可采用机械破碎和酶解相结合的方细胞破碎可采用机械破碎和酶解相结合的方法，以提高破碎效率。包含体纯化过程中也法，以提高破碎效率。包含体纯化过程中也

39、可利用核酸水解酶，提高核酸去除率。可利用核酸水解酶，提高核酸去除率。De De Bernardez ClarkBernardez Clark等提出的利用酶解辅助细等提出的利用酶解辅助细胞破碎和包含体纯化的过程如下胞破碎和包含体纯化的过程如下（路线（路线II)II)：p离心分离，回收细胞。离心分离，回收细胞。p向回收的细胞中加入含向回收的细胞中加入含lmmol/L EDTAlmmol/L EDTA和和1.1.5mg/mL5mg/mL溶菌酶的溶菌酶的TrisTris缓冲溶液（三羟甲基氨缓冲溶液（三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液）基甲烷缓冲溶液）(0.lmol/L,pH=7.0)(0.lmol/L,pH=7

40、.0)，细，细胞浓度为胞浓度为20g/L20g/L（湿重），总体积为（湿重），总体积为V V。放置。放置30min30min。六、包含体的分离纯化与溶解六、包含体的分离纯化与溶解p细胞破碎细胞破碎：反复机械破碎，使细胞破碎完全。：反复机械破碎，使细胞破碎完全。p核酸水解：核酸水解：向细胞破碎液中加入向细胞破碎液中加入DNADNA水解酶水解酶(DNase(DNase）至）至10g/mL10g/mL和和MgCl2MgCl2至至3mmol/L3mmol/L。2525温浴温浴30min30min，水解，水解DNADNA。p包含体洗涤：包含体洗涤：向上述悬浮液中加人向上述悬浮液中加人Triton X-1

41、00Triton X-100至至20g/L,NaCl20g/L,NaCl至至1.5mo1/L,EDTA1.5mo1/L,EDTA至至20mmo1/L,20mmo1/L,悬浮悬浮液体积为液体积为3V3V。44搅拌搅拌30min30min。p离心分离回收包含体。离心分离回收包含体。p包含体洗涤：包含体洗涤：向回收的包含体中加入向回收的包含体中加入TrisTris至至0.lmol/L(pH=7.0),EDTA0.lmol/L(pH=7.0),EDTA至至20mmol/L,20mmol/L,悬浮液体积悬浮液体积为为8V8V。p 离心分离回收纯化的包含体。离心分离回收纯化的包含体。六、包含体的分离纯化与

42、溶解六、包含体的分离纯化与溶解p3 3、包含体的溶解、包含体的溶解 目的：目的：获得适当纯度的包含体后，需要获得适当纯度的包含体后，需要对包含体进行溶解，对包含体进行溶解，使目标蛋白质的肽链使目标蛋白质的肽链伸展，为进一步的复性创造条件。伸展，为进一步的复性创造条件。方法：方法：包含体溶解的方法：包含体溶解的方法：1 1、加入高浓度的强变性剂：如、加入高浓度的强变性剂：如6-6-8mol/L8mol/L的盐酸胍或的盐酸胍或8mol/L8mol/L的尿素。的尿素。2 2、加入硫氰酸盐或表面活性剂。、加入硫氰酸盐或表面活性剂。3 3、对于含有二硫键的蛋白质，还需、对于含有二硫键的蛋白质，还需加入还

43、原剂解离错配的二硫键。加入还原剂解离错配的二硫键。六、包含体的分离纯化与溶解六、包含体的分离纯化与溶解p常用的还原剂有常用的还原剂有1-100mmol/L1-100mmol/L的二硫苏糖醇（的二硫苏糖醇（DTTDTT），），1-200mmol/L1-200mmol/L的的-巯基乙醇和半胱氨酸等，有时还需巯基乙醇和半胱氨酸等，有时还需要加入螯合剂要加入螯合剂,以清除重金属离子（如加入以清除重金属离子（如加入2mol/L2mol/L的的EDTAEDTA等）。等）。p注意：溶解后的包含体蛋白质中仍会存在一些诸如非注意：溶解后的包含体蛋白质中仍会存在一些诸如非目标蛋白质、核酸和细胞膜组分等杂质，为了提

44、高复目标蛋白质、核酸和细胞膜组分等杂质，为了提高复性收率，在复性前要对变形性收率，在复性前要对变形/还原的蛋白质进一步纯还原的蛋白质进一步纯化。主要方法有化。主要方法有凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱和固定化金属离子色谱等。纯化操作中使用的流色谱和固定化金属离子色谱等。纯化操作中使用的流动相需保证蛋白质处于变性动相需保证蛋白质处于变性/还原状态，如苯酚、正还原状态，如苯酚、正丁醇等。丁醇等。如果要保存变性蛋白质，可以将蛋白质变换如果要保存变性蛋白质，可以将蛋白质变换到酸性溶液中（到酸性溶液中（10%10%醋酸或醋酸或5-10mmol/L5-10mmol/L盐

45、酸），并冷盐酸），并冷冻干燥。复性前用变性剂重新溶解干粉，就可以进行冻干燥。复性前用变性剂重新溶解干粉，就可以进行蛋白质的复性操作。蛋白质的复性操作。七、蛋白质复性七、蛋白质复性p(一一)蛋白质复性的方法蛋白质复性的方法七、蛋白质复性七、蛋白质复性p1 1、直接稀释复性：、直接稀释复性：即将变性蛋白质溶液直接稀释即将变性蛋白质溶液直接稀释到适宜的复性缓冲液中。到适宜的复性缓冲液中。p变性蛋白质是溶解在高浓度变性剂中的，降低变变性蛋白质是溶解在高浓度变性剂中的，降低变性剂浓度至非变性浓度范围即可引发蛋白质的折性剂浓度至非变性浓度范围即可引发蛋白质的折叠复性。当变性剂浓度降低后，伸展的肽链叠复性。

46、当变性剂浓度降低后，伸展的肽链U U迅迅速折叠成具有丰富的二级结构（速折叠成具有丰富的二级结构（螺旋和螺旋和折叠折叠结构）和部分三级结构的中间体结构）和部分三级结构的中间体I I，该过程非常，该过程非常迅速，通常在几毫秒内完成，因此，迅速，通常在几毫秒内完成，因此，I I的生成可的生成可以认为是瞬间完成（即以认为是瞬间完成（即kiki）,蛋白质的折叠蛋白质的折叠复性和聚集体的形成过程可以简化为从中间体复性和聚集体的形成过程可以简化为从中间体I I折叠成天然活性态折叠成天然活性态N N和生成聚集体和生成聚集体A A的平行反应。的平行反应。A A Ka Ka I I Kr Kr N N七、蛋白质复

47、性七、蛋白质复性p注意：聚集体的形成是蛋白质过量表达的注意：聚集体的形成是蛋白质过量表达的结果。因此，在这个过程中，蛋白质的复结果。因此，在这个过程中，蛋白质的复性收率一般是随变性蛋白质溶液浓度的提性收率一般是随变性蛋白质溶液浓度的提高而降低的，而聚集体的生成速率随浓度高而降低的，而聚集体的生成速率随浓度的提高而增大。即：的提高而增大。即：UU则则I,NI,N。因此，。因此，在稀释复性过程中，若复性系统的混合不在稀释复性过程中，若复性系统的混合不利，会造成局部蛋白浓度过高，使复性收利，会造成局部蛋白浓度过高，使复性收率下降，在设计复性反应器时，要尽量考率下降，在设计复性反应器时，要尽量考虑混合

48、搅拌均匀。虑混合搅拌均匀。七、蛋白质复性七、蛋白质复性p对于含有二硫键的蛋白质的复性，需要添加氧对于含有二硫键的蛋白质的复性，需要添加氧化剂和还原剂，调节复性液的氧化还原环境，化剂和还原剂，调节复性液的氧化还原环境，促进正确二硫键的形成，促进正确二硫键的形成，常见的氧化常见的氧化/还原剂有：还原剂有：氧化型谷光甘肽（氧化型谷光甘肽（GSSGGSSG）/还原型谷光甘肽还原型谷光甘肽（GSHGSH）,胱氨酸胱氨酸/半胱氨酸或在金属离子（如半胱氨酸或在金属离子（如Cu2+Cu2+）存在下的空气中氧化。）存在下的空气中氧化。p氧化复性通常在弱碱性（氧化复性通常在弱碱性（pH=7.5-9.5pH=7.5

49、-9.5）缓冲溶）缓冲溶液中进行，在此液中进行，在此pHpH值条件下有利于硫醇阴离子值条件下有利于硫醇阴离子的形成，促进二硫键的形成和交换。同时，的形成，促进二硫键的形成和交换。同时，氧氧化还原剂的浓度对复性收率影响显著。具体浓化还原剂的浓度对复性收率影响显著。具体浓度范围要根据实验确定。度范围要根据实验确定。因为，一般情况下，因为，一般情况下，不同蛋白质的最佳复性条件不同，并且同一种不同蛋白质的最佳复性条件不同，并且同一种蛋白质在不同浓度下的最佳条件也不完全相同，蛋白质在不同浓度下的最佳条件也不完全相同，这也是蛋白质复性的特点和难点之一。这也是蛋白质复性的特点和难点之一。七、蛋白质复性七、蛋

50、白质复性p2 2、流加复性、流加复性 p降低蛋白质浓度有利于获得较高的复性收率，降低蛋白质浓度有利于获得较高的复性收率，因因此，为了提高复性收率，通常需要在较低的浓度此，为了提高复性收率，通常需要在较低的浓度下进行蛋白质复性操作，有时蛋白质的浓度需低下进行蛋白质复性操作，有时蛋白质的浓度需低于于0.01mg/ml0.01mg/ml。但是，降低蛋白质浓度势必会增大。但是，降低蛋白质浓度势必会增大复性液的体积，给后续的分离纯化增加困难。为复性液的体积，给后续的分离纯化增加困难。为了实现高浓度下的高收率复性，产生了了实现高浓度下的高收率复性，产生了将变性蛋将变性蛋白质分批次加入到复性液中或采用连续流