动物细胞与组织培养技术.ppt

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1、第三章第三章动物细胞与组织培养技术动物细胞与组织培养技术第一节第一节概述概述一、动物细胞与组织培养的基本概念一、动物细胞与组织培养的基本概念二、动物细胞体外培养的特点二、动物细胞体外培养的特点三、发展历史三、发展历史四、动物细胞的体外培养一般条件四、动物细胞的体外培养一般条件(掌握）掌握）五、体外培养细胞生物学特性五、体外培养细胞生物学特性(掌握）掌握）第二节第二节动物细胞、组织培养的基本方法动物细胞、组织培养的基本方法(掌握）掌握）第三节第三节培养细胞的检测和特性鉴定培养细胞的检测和特性鉴定(掌握）掌握）第四节第四节动物细胞体外培养举例动物细胞体外培养举例 第五节第五节细胞同步化（了解）细胞

2、同步化（了解）第六节第六节组织工程、器官培养（定义、培养方法及应用（了解）组织工程、器官培养（定义、培养方法及应用（了解）第一节第一节概述概述一、基本概念一、基本概念1动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养(CellandTissueCulture)：指从用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模：指从用无菌方法将动物体内细胞或组织取出，模拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞拟体内的生理环境，在体外进行培养，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。l 是动物细胞工程的基础。是动物细胞工程的基础。v分类：细胞培养 组织培养 器官培养2

3、2、原代培养、原代培养(Primary Culture)(Primary Culture)：亦称初代培养，指直接从亦称初代培养，指直接从机体取出的细胞或组织进行培养的过程。机体取出的细胞或组织进行培养的过程。3 3继代培养（继代培养（Secondary CultureSecondary Culture ）：亦称传代培：亦称传代培养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养养，从原代培养的细胞继续转接培养称继代培养.4 4、细胞系细胞系(cell line)(cell line)：由原代细胞培养后经初步纯由原代细胞培养后经初步纯化，获得的以一种细胞为主、能在体外长期生存的化，获得的以一种细胞为主、

4、能在体外长期生存的不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。不均一的细胞群体，一般为有限细胞系。5 5、细胞株、细胞株(cell strain)(cell strain)：细胞系经过克隆或其他方：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。法而得的单一类型的细胞群体。有限细胞系有限细胞系(infinitedcellline)：不能连续培养的细胞株。不能连续培养的细胞株。无限细胞系无限细胞系(finitedcellline)：能够连续培养的细胞株，能够连续培养的细胞株，也称无限系。也称无限系。无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的无限系细胞大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶

5、性细胞。可能已成为恶性细胞。细胞株、细胞系的命名：细胞株、细胞系的命名：l 以组织来源定名，如以组织来源定名，如BHK(BHK(幼地鼠肾细胞幼地鼠肾细胞)l 以人名定名，如以人名定名，如HeLaHeLa细胞细胞l 以时间地点来定名，如以时间地点来定名，如S7811S7811细胞系细胞系l 以临床疾病类型定名，如以临床疾病类型定名，如BALL-1BALL-1细胞系细胞系(来来自自B B淋巴细胞急性白血病人白细胞淋巴细胞急性白血病人白细胞)用于生产的用于生产的动物细胞株动物细胞株原代细胞原代细胞二倍体细胞二倍体细胞融合细胞融合细胞基因工程细胞基因工程细胞转化细胞转化细胞常用细胞株：常用细胞株：CH

6、O细胞、细胞、Vero细胞、细胞、BHK-21细胞、细胞、WI-38细胞细胞二、动物细胞体外培养特点二、动物细胞体外培养特点v动物细胞动物细胞生长缓慢生长缓慢，培养时间长。，培养时间长。v更易受微生物污染更易受微生物污染 （包括细菌、真菌、病毒、支原体），（包括细菌、真菌、病毒、支原体），需要需要防治污染问题防治污染问题。v对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括对培养环境的适应性差，对环境极其敏感。包括PHPH值、温值、温度、剪切力度、剪切力v对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半对营养要求高，除了氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，一般还需要血清。乳糖外，一般还需要血清。

7、v原代细胞一般繁殖原代细胞一般繁殖5050代左右退化死亡。代左右退化死亡。总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。总之，动物细胞培养对各方面的要求更高，培养难度更大。平滑肌细胞平滑肌细胞神经元细胞神经元细胞血红细胞血红细胞形态上表现为形态上表现为多种多样，如多种多样，如圆形、椭圆形、圆形、椭圆形、正方形、柱形、正方形、柱形、扁平形、梭形、扁平形、梭形、星形和多边形星形和多边形等等三、动物细胞培养的发展历史三、动物细胞培养的发展历史v1885年，年，Wilhelm Roux（劳斯，德国）最先尝试离体培（劳斯，德国）最先尝试离体培养鸡胚神经存活了一段时间。并且，他首次采用了养鸡胚神经存

8、活了一段时间。并且，他首次采用了“组组织培养织培养”一词。一词。v1907年，美国胚胎学家年，美国胚胎学家Ross Harrison（哈里森）培养蛙（哈里森）培养蛙胚神经细胞长出了轴突胚神经细胞长出了轴突（盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法）。他被公认为动物组织培养的开山鼻祖。他被公认为动物组织培养的开山鼻祖。v1912年年,法国学者法国学者Alexis Carrel（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组（卡雷尔）采用鸡胚匀浆组织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。织液与血浆混合使用，培养了各种动物组织的组织块。在技术方面，卡雷尔把无菌操作技术引入组织培养中。在技术方面，卡

9、雷尔把无菌操作技术引入组织培养中。1923年，他设计了卡氏培养瓶。年，他设计了卡氏培养瓶。v1913年，年，Steinhardt建立了单盖片悬滴培养法。建立了单盖片悬滴培养法。v1925年，年，Maximow采用双盖片法。采用双盖片法。v1934年，年，Gey和和Lewis 用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计用旋转管培养了许多细胞系。相继，人们设计了多种类型的培养瓶。了多种类型的培养瓶。v1948年，年，Sanford创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还创立了单层细胞培养法，建立了各种细胞系。他还创建了单个细胞培养方法。创建了单个细胞培养方法。v1951年，年，Pomerat设计

10、了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断设计了细胞培养灌流小室技术，使细胞生活在不断更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究更新的培养液环境中，便于做细胞显微摄影和代谢等研究v1951年，年，厄尔厄尔（Earle）发明了体外培养动物细胞的人工合成培养发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。基。v1952年年Gey建立了第一个人体细胞系，人体宫建立了第一个人体细胞系，人体宫颈癌颈癌Hela细胞系。细胞系。v1960年，年，Barski等人在两种不同类型的细胞混合等人在两种不同类型的细胞混合培养物中发现有自发的融合细胞。培养物中发现有自发的融合细胞。v1962年，冈田善雄又发现了已灭活的

11、仙台病毒可年，冈田善雄又发现了已灭活的仙台病毒可以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。以诱发体内艾氏腹水瘤细胞和非恶性细胞融合。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。且融合细胞染色体丢失，恶性特征受到抑制。四、动物细胞的体外培养一般条件四、动物细胞的体外培养一般条件1、恒定的温度恒定的温度:37v维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为准温度为36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，

12、温度上升不超过培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细时，细胞代谢与温度成正比；胞代谢与温度成正比；v人体细胞在人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；v在在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；v41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；复可能；v当温度在当温度在43以上以上1小时，细胞全部死亡。小时，细胞全部死亡。低温下会使细胞代谢速率降低低温下会使细胞代谢速率

13、降低2、pH：最适为：最适为7.27.4v大多数细胞的适宜大多数细胞的适宜pH为为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境在偏酸环境中更利于细胞生长中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如如成纤维细胞最适合成纤维细胞最适合pH是，每种细胞都有其最适是，每种细胞都有其最适pH值值.v当当PHPH低于低于6 6或高于或高于7.67.6时的生长会受到影响，甚至死亡。时的生长会受到影响，甚至死亡。3、气体气体v气体：需要气体：需要O2、CO

14、2（95%空气、空气、5%CO2）v气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要所需气体主要有氧气和二氧化碳有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时开放培养时一般把细胞置于一般把细胞置于95%空气加空气加5%二氧化碳混合气体环境中二氧化碳混合气体环境中.v二氧化碳既是细胞代谢产物二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分也是细胞生长繁殖所需成分,它它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的在细胞培养中的主

15、要作用在于维持培养基的pH值值.4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、激素、生长因子等。核酸、激素、生长因子等。5、无菌、无菌v培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维

16、持存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。细胞生存的基本条件。（一）培养细胞的生长方式及类型（一）培养细胞的生长方式及类型（二）培养细胞的生长特点（二）培养细胞的生长特点（三）（三）培养细胞的生长与增殖过程培养细胞的生长与增殖过程五、五、动物细胞的体外培养生物学特性动物细胞的体外培养生物学特性贴壁依赖型细胞贴壁依赖型细胞 非贴壁依赖型非贴壁依赖型成纤维细胞成纤维细胞上皮型细胞上皮型细胞游走型细胞游走型细胞多形型细胞多形型细胞（一）培养细胞的生长方式及类型（一）培养细胞的生长方式及类型 于悬浮状态下于悬浮状态下即可生长即可生长贴附于支持物表面贴附于支持物表面才能生长的细胞才能生

17、长的细胞1、贴壁依赖型细胞、贴壁依赖型细胞v含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外含义：一是细胞之间相互接触，二是细胞与细胞外基质结合。基质结合。v 单层附壁培养：指动物细胞培养中，大多细胞必须单层附壁培养：指动物细胞培养中，大多细胞必须附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生附着在固体表面生长，当细胞布满表面后即停止生长。长。v在体外按照培养细胞的形态不同，主要可分为以下几类：在体外按照培养细胞的形态不同，主要可分为以下几类：成纤成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞 （1 1）成纤维细胞型：）成纤维细胞型：本型细胞的形态似在体

18、内生长的成纤维细胞；本型细胞的形态似在体内生长的成纤维细胞；长梭形，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞核长梭形，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞核位于中央，胞质向外伸出位于中央，胞质向外伸出2-32-3个长短不同的突起，个长短不同的突起，生长时呈放射生长时呈放射状、漩涡状走向状、漩涡状走向，细胞间间隙较大。，细胞间间隙较大。其生长特点为细胞一般并不紧靠相连；其生长特点为细胞一般并不紧靠相连；中胚层细胞体外培养时一般表现为这一形式。如人胚肺细胞。中胚层细胞体外培养时一般表现为这一形式。如人胚肺细胞。人的成纤维细胞人的成纤维细胞小鼠的成纤维细胞小鼠的成纤维细胞人骨髓间充质

19、细人骨髓间充质细胞（胞（MSCMSC）大鼠血管平滑肌细胞大鼠血管平滑肌细胞成纤维细胞型成纤维细胞型v成纤维型细胞成纤维型细胞在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名纤维细胞的形态相似而得名.除真正的成纤维细胞除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。生长。v人胚肺细胞在显微镜下呈现为典型的成纤维细胞型。人胚肺细胞在显微镜下呈现为典型的成纤维细胞型。（2 2）上皮型细胞上皮型细

20、胞此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平状，不规则。此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平状，不规则。细胞贴壁后呈不规则多角形，中央有细胞贴壁后呈不规则多角形，中央有扁扁圆形核，细胞彼此圆形核，细胞彼此紧密相连成单层紧密相连成单层细胞，呈现细胞，呈现“铺路石状铺路石状”。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。单独行动。内胚层和外胚层细胞体外培养时都可能呈现上皮型。如皮内胚层和外胚层细胞体外培养时都可能呈现上皮型。如皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管内皮肤、消化道、呼吸道、肺泡、消化腺上皮细胞，血管内皮细胞

21、等。细胞等。vHela细胞呈现为典型的上皮细胞型细胞呈现为典型的上皮细胞型。单层扁平上皮细胞单层扁平上皮细胞人口腔皮样癌细胞人口腔皮样癌细胞人宫颈癌上皮细胞（人宫颈癌上皮细胞（HelaHela）成骨肉瘤细胞成骨肉瘤细胞(多角形多角形)上皮细胞型上皮细胞型奶牛肾脏上皮细胞奶牛肾脏上皮细胞(上皮细胞型上皮细胞型)v体外培养时所谓的上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅体外培养时所谓的上皮细胞型细胞或成纤维细胞型细胞，仅是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，是因为其形态与体内的上皮细胞或成纤维细胞类似，并不能并不能将体外培养的这些细胞与体内同名的细胞完全等同；将体外培养的这些细胞与体内同名的细

22、胞完全等同；而且，而且，这种名词系使这种名词系使用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源用于描述细胞的外形而并非说明细胞的起源。与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。与这两种形态类似的细胞，可能来自不同性质的细胞亚类。取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态要有取自不同组织的上皮细胞，其生化特征及其原来的形态要有差异，而来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的差异，而来自不同组织的形态相似的成纤维细胞，其发展的方向可能并不相同方向可能并不相同。（3 3）游走型细胞：）游走型细胞：不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。不常见，具有类似巨噬细胞样的特征。本型细胞在支持物上散在生

23、长，一般不连成片。细胞本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。似多角型或成纤维细胞形态。如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细如单核巨噬细胞系统的细胞中的颗粒型白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。胞、巨噬细胞、肿瘤细胞等。体外培养的游走型细胞具有

24、类似巨噬细体外培养的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。主要是：单核巨噬细胞系统胞样的特征。主要是：单核巨噬细胞系统的细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。的细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞。单 核 巨 噬 细 胞1、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成、游走型细胞在支持物上分散生长，一般不连接成片、形成群落；片、形成群落；2、细胞胞质常伸出伪足和突起。、细胞胞质常伸出伪足和突起。3、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、生长位置不固定，呈游走和变形运动，速度快、方向不规则。方向不规则。4、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。、细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。单核巨噬细胞（未刺激状态）单核巨噬细胞（未刺激状态）

25、游走细胞型游走细胞型单核巨噬细胞（活化剂刺激单核巨噬细胞（活化剂刺激6h后）：向四周伸展伪足后）：向四周伸展伪足需要注意的是：在实际细胞培养中，可能同时存在需要注意的是：在实际细胞培养中，可能同时存在2 2种及其以上种及其以上细胞形态；其影响因素包括（细胞形态；其影响因素包括（1 1）不同来源细胞细胞形态学表现）不同来源细胞细胞形态学表现不同；（不同；（2 2）不同培养条件下同一细胞表现不同形态；如血清成）不同培养条件下同一细胞表现不同形态；如血清成分，培养基，温气环境等分，培养基，温气环境等（4 4）多形型细胞：）多形型细胞：形态上不规则的细胞，形态上不规则的细胞，不常不常见，见，一般分胞体

26、和胞突两部分一般分胞体和胞突两部分，胞突细长形，胞突细长形类似丝状伪足；胞体略呈多角形，但较规则。类似丝状伪足；胞体略呈多角形，但较规则。如神经组织细胞如神经元、神经胶质细胞等。如神经组织细胞如神经元、神经胶质细胞等。神经细胞（神经细胞（DAB显色）显色）多形型细胞多形型细胞神经细胞神经细胞大鼠大鼠 海马神经细胞海马神经细胞2 非贴附型细胞非贴附型细胞 v 悬浮型细胞：指细胞在体外培养时不必贴壁，可在培养液悬浮型细胞：指细胞在体外培养时不必贴壁，可在培养液中悬浮生长。中悬浮生长。v见于少数特殊的细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、杂交瘤见于少数特殊的细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、杂交瘤细胞转

27、化细胞系、某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆细胞转化细胞系、某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。v这种细胞的形态特点：胞体始终为球形。这种细胞的形态特点：胞体始终为球形。v优点：生存空间大，培养效率高，利于大量生产，与培养基充优点：生存空间大，培养效率高，利于大量生产，与培养基充分接触无需消化传代，易于收获细胞。分接触无需消化传代，易于收获细胞。v缺点是不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都缺点是不如贴附生长型观察方便，而且并非所有的培养细胞都能悬浮生长。能悬浮生长。v 贴壁细胞经悬浮适应后也可以长期悬浮培养贴壁细胞经

28、悬浮适应后也可以长期悬浮培养实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现某实际情况下，所培养的细胞并不一定呈现某种典型的形态，能影响细胞形态的因素很多，种典型的形态，能影响细胞形态的因素很多，细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的细胞形态学特征仅是对培养物判断或识别的一种参考性指标，如果想明确某一培养物的一种参考性指标，如果想明确某一培养物的确切类型，必须借助于更为特异的鉴定方法。确切类型，必须借助于更为特异的鉴定方法。n影响细胞形态学特征的因素影响细胞形态学特征的因素血清成分、培养基成分、添加成分、培养血清成分、培养基成分、添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。基的酸碱度、气相环境、温度等。如

29、如,Hela细胞原本是一种上皮型癌细胞细胞原本是一种上皮型癌细胞,但但在过酸或过碱的条件下培养在过酸或过碱的条件下培养,可以呈现梭形可以呈现梭形,当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。当酸碱度适中时又可以恢复上皮型特征。(二）培养细胞的生长特点二）培养细胞的生长特点贴附和伸展贴附和伸展接触抑制接触抑制密度抑制密度抑制1贴附贴附贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。贴附并伸展，是多数体外培养细胞的基本生长特点。v贴附底物：其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。一类特贴附底物：其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。一类特殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连接素、殊的促细胞附着的物质（如基膜素、纤维连接素、

30、型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。型胶原、血清扩展因子等）可能参加细胞的贴附过程。v培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样；当与底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态。底物贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形态。v细胞贴附和伸展过程：细胞贴附和伸展过程：贴附过程：促细胞附着因子吸附于底物上贴附过程：促细胞附着因子吸附于底物上悬浮的圆形细胞与底物附着悬浮的圆形细胞与底物附着细胞将伸展成其原来的形态细胞将伸展成其原来的形态。贴附过程贴附过程 v影响细胞的贴附和伸展的因素：细胞因素；生物因影响细胞的贴附和伸展的因素：细胞因素；生物因素

31、（如促附着因子）；素（如促附着因子）；机械、物理因素（如低温或机械、物理因素（如低温或培养液的流动过快培养液的流动过快)；其它一些因素的影响（例如：；其它一些因素的影响（例如：离子的作用离子的作用).v可采取的措施：可采取的措施：包被；包被；减少接种时细胞悬液的减少接种时细胞悬液的量；量；培养液中离子成分及浓度培养液中离子成分及浓度培养液的温度培养液的温度2接触抑制（接触抑制（Contactinhibition）细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多相互接触后，不再增加。互接触后，不再增加。v一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长；

32、但是，转化一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长；但是，转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，他们互相之间可在上面或细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降，他们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。下面经过而重叠生长。3、密度依赖性、密度依赖性（Densityinhibition）v3T3细胞系，在细胞稀少状态下培养时，其生长迅细胞系，在细胞稀少状态下培养时，其生长迅速；但一旦细胞生长汇合成一片时（每速；但一旦细胞生长汇合成一片时（每6cm培养皿培养皿约约106个细胞），其分裂增殖停止。其确切的细胞密个细胞），其分裂增殖停止。其确切的细胞密度常与培养液中的血清浓度有关。上述这种生长特度常与培养液中的血清浓

33、度有关。上述这种生长特性即为密度依赖性调节（或密度抑制）。性即为密度依赖性调节（或密度抑制）。v转化细胞或恶性肿瘤细胞则与正常细胞不同，他们转化细胞或恶性肿瘤细胞则与正常细胞不同，他们的密度依赖性调节常常降低，因而可以生长至较高的密度依赖性调节常常降低，因而可以生长至较高的终末细胞密度。的终末细胞密度。（四）（四）体外培养细胞的生长与增殖过程体外培养细胞的生长与增殖过程 1、单个细胞的生长过程：、单个细胞的生长过程：与体内细胞周期相似，经历与体内细胞周期相似，经历G1、S、G2、M期。期。细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为细胞分裂时间为细胞分裂时间

34、为细胞分裂时间为121248h48h，细胞的分裂细胞的分裂细胞的分裂细胞的分裂 周期周期周期周期=间期间期间期间期+分裂期分裂期分裂期分裂期 间期（间期（间期（间期（G1+S+G2G1+S+G2）分裂期（分裂期（分裂期（分裂期（MM）体外培养细胞寿命的过程可分为三个阶段体外培养细胞寿命的过程可分为三个阶段 原代培养期原代培养期 传代期传代期 衰退期衰退期 2、细胞系的生长过程：细胞系的生长过程：(1)原代培养（初代培养）原代培养（初代培养）v为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶为新鲜组织自体内取出接种培养至第一次传代的阶段段,一般持续一般持续14周。周。v 特点：原代细胞培养通常为异质

35、性，细胞独立生特点：原代细胞培养通常为异质性，细胞独立生存性差，多呈二倍体核型，更能代表其来源组织的存性差，多呈二倍体核型，更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性，是检测药物的很好实验工细胞类型及组织特异性，是检测药物的很好实验工具。具。(2)传代期传代期 v当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的细胞密当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的细胞密度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿中，并补充更新培养液，此即为传代。的培养器皿中，并补充更新培养液，此即为传代。u特点特点:在细胞整个生命期中此期的持续时间最长，在细胞整个生命期中此期的

36、持续时间最长，一般情况下，可传代一般情况下，可传代1050代。代。细胞增殖旺盛，并细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，被称为二倍体核型。能维持二倍体核型，被称为二倍体核型。v有限细胞系和永久细胞系有限细胞系和永久细胞系v 动物细胞离体培养起始物，我们称之为原代培养（动物细胞离体培养起始物，我们称之为原代培养（primaryculture）。经继代）。经继代培养后即成为有限细胞系培养后即成为有限细胞系(finitecellline)。v有限细胞系：有限细胞系：细胞自动物体内取出后，在培养中仅持续生长有限时间，然后将自细胞自动物体内取出后，在培养中仅持续生长有限时间，然后将自行停止生长。即使提供生长

37、所需的营养物质（包括血清），最终也会死亡。这种行停止生长。即使提供生长所需的营养物质（包括血清），最终也会死亡。这种寿命仅能维持一段时间的细胞系，称为有限细胞系。寿命仅能维持一段时间的细胞系，称为有限细胞系。v 大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。v 有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动

38、，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化物细胞培养中称为体外转化(invitrotransformation)。v 永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高永久细胞系有如下特征：细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降的核质比；生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小；贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。荧光原位杂交显示端粒荧光原位杂交显示端粒荧光原位杂交显示端粒荧光原位杂交显示端粒结果：细

39、胞群体中具有迅结果：细胞群体中具有迅速增殖能力的细胞将渐占速增殖能力的细胞将渐占优势而非增殖的或增殖缓优势而非增殖的或增殖缓慢的细胞将被减弱。慢的细胞将被减弱。(3)衰退期，此期细胞虽仍存活，但增殖基本停衰退期，此期细胞虽仍存活，但增殖基本停止，细胞形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、止，细胞形态轮廓增强，进而细胞发生衰退、死亡。死亡。v 细胞在第二期末或第三期初阶段，通过所细胞在第二期末或第三期初阶段，通过所谓谓“危机期危机期”(crisis)，获得不死性而具有，获得不死性而具有持久或无限增殖的能力。失去接触抑制。持久或无限增殖的能力。失去接触抑制。3、每代细胞的生长过程、每代细胞的生长过程在细

40、胞的生长过程中，繁殖到一定密度后，将之分在细胞的生长过程中，繁殖到一定密度后，将之分开而移至新的培养皿中称为接种。开而移至新的培养皿中称为接种。细胞细胞”一代一代”：仅指从细胞接种到分离再培养的一：仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间。段时间。潜伏期潜伏期每代细胞的生长阶段每代细胞的生长阶段：指数生长期指数生长期 停止期停止期v培养细胞传代的生存期：培养细胞传代的生存期：1)潜伏期潜伏期(latentphase)2)指数生长期指数生长期(logarithmicgrowthphase)又称对数又称对数期期-试验用试验用3)平台期又称生长停滞期平台期又称生长停滞期(stagnatephase)。-

41、传传代代1）潜伏期）潜伏期2）指数生长期指数生长期v细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。持续究。持续35天。天。v细胞生长增殖状况可以细胞群体倍增时间及细胞分裂指数细胞生长增殖状况可以细胞群体倍增时间及细胞分裂指数等来判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条件，将不等来判断。在此阶段，若细胞处于理想的培养条件，将不断生长繁殖，细胞数量日渐增加。细胞将接触而连成一片，断生长繁殖，细胞数量日渐增加。细胞将接触而连成一片，渐次铺满培养器皿底物，提供细胞生长的区域逐渐减少甚渐次铺满培养器皿底物，提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失。因接触

42、抑制而细胞运动停止、密度抑制而细胞终至消失。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制而细胞终止分裂。细胞不再繁殖而进入平台期。止分裂。细胞不再繁殖而进入平台期。3 平台期平台期v又称生长停滞期。又称生长停滞期。v此期细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞量和此期细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞量和密度达到饱和，细胞停细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖，密度达到饱和，细胞停细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖，细胞数量持平。细胞数量持平。v特点细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一特点细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至

43、定的时间。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至新的培养器皿并补充以新鲜培养液，细胞将于培养器皿中成新的培养器皿并补充以新鲜培养液，细胞将于培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。否则细胞因中毒而发生死亡。为下一代的细胞而再次繁殖。否则细胞因中毒而发生死亡。第二节第二节动物细胞、组织培养的方法动物细胞、组织培养的方法 一、体外培养的一般过程一、体外培养的一般过程二、动物细胞培养的基本方法二、动物细胞培养的基本方法三、动物细胞大规模培养技术三、动物细胞大规模培养技术 四、动物细胞体外培养举例四、动物细胞体外培养举例 五、动物细胞体外培养现状与展望五、动物细胞体外培养现状与展望一、体外培养的一般

44、过程一、体外培养的一般过程v体外细胞培养一般过程：体外细胞培养一般过程：组织获得组织获得 组织消化组织消化 接种接种培养培养传代及传代及细胞冻存复苏等细胞冻存复苏等动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬液细胞悬液胰蛋白酶胰蛋白酶1代细胞代细胞原代培养原代培养50代细胞代细胞传代培养传代培养无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液加培养液动物组织细胞间隙中动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织定弹性和韧性的组织和器官。和器官。（分解弹性纤维）（分解弹性纤维）动物细

45、胞培养的基本过程动物细胞培养的基本过程过程过程 组织组织取材取材 组织细胞的分离分离 培养培养 机械法机械法 消化法消化法 机机械械法法分分离离胚胚胎胎（二）、（二）、原代培养与传代培养技术原代培养与传代培养技术 1、原代培养分为两种：、原代培养分为两种：1）组织块培养法组织块培养法 2）组织消化培养（单层培养法）：适用于细胞间质组织消化培养（单层培养法）：适用于细胞间质较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝肾及传代细较少的软组织，如胚胎、羊膜、上皮、肝肾及传代细胞等。胞等。v一般而言幼体组织比老龄组织，分化低的比分化高，一般而言幼体组织比老龄组织，分化低的比分化高，肿瘤组织比正常组织易于培养。

46、肿瘤组织比正常组织易于培养。（一）取材（一）取材 基本步骤：无菌取出目的组织基本步骤：无菌取出目的组织 用利刀无菌切割成用利刀无菌切割成1 12mm2mm小块小块 以以HanksHanks液漂洗干净液漂洗干净,低速离心，弃上清低速离心，弃上清 移入培养瓶，加入适当培养基浸润移入培养瓶，加入适当培养基浸润 培养瓶翻转培养瓶翻转1801800 0，置，置15153030分，使其贴壁分，使其贴壁 培养瓶翻回，置于培养瓶翻回，置于3737培养培养（1）组织块培养）组织块培养 组织块培养法组织块培养法 a：取材修剪冲洗：取材修剪冲洗b：剪切成：剪切成1mm3左右的小块左右的小块c：移入培养瓶：移入培养瓶

47、d：分布组织小块间距：分布组织小块间距5mme：翻转培养瓶并加培养液：翻转培养瓶并加培养液37静止静止1-2hf：翻正培养瓶进行培养：翻正培养瓶进行培养g：原代细胞生长：原代细胞生长 取材分离和组织消化取材分离和组织消化 无菌取出目的组织无菌取出目的组织 用利刀无菌切割成细块用利刀无菌切割成细块 胰蛋白酶液消化胰蛋白酶液消化 Hanks Hanks液漂洗两次，低速离心弃上清液漂洗两次，低速离心弃上清 吸管吹打分散细胞吸管吹打分散细胞 移入培养瓶薄层培养移入培养瓶薄层培养(2)组织消化培养组织消化培养 加入加入30-50倍体积倍体积0.25%浓度胰蛋白酶溶液浓度胰蛋白酶溶液3737消化消化30-

48、60min30-60min，每，每5-10min5-10min摇动一次摇动一次相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原相关酶类包括：胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等，需根据酶及组织成分的牛酶等，需根据酶及组织成分的特点选择使用特点选择使用原代培养与检查原代培养与检查 v 接种、培养接种、培养 v v 常规检查常规检查（检查细胞形态及活力、检查营养液（检查细胞形态及活力、检查营养液pH及污染）及污染）2、传代培养技术、传代培养技术传代：当原代培养成功后，细胞分裂增殖成片时，传代：当原代培养成功后，细胞分裂增殖成片时，需要对其分离重新培养，这一操作过程成为传代。需要

49、对其分离重新培养，这一操作过程成为传代。第一次传代时间第一次传代时间：有有80-90%或刚刚全部汇合的细胞或刚刚全部汇合的细胞是传代的理想时期。过早产量不足，过晚细胞状态是传代的理想时期。过早产量不足，过晚细胞状态不佳。不佳。基本步骤：基本步骤：吸出培养瓶内旧培养液吸出培养瓶内旧培养液 加入胰蛋白酶和加入胰蛋白酶和EDTAEDTA混和液混和液 (以能覆盖整个瓶底为准）以能覆盖整个瓶底为准）吸出消化液，加入培养液终止消化吸出消化液，加入培养液终止消化 吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液，计数 重新接种重新接种于新的培养瓶内于新的培养瓶内1）贴壁生长细胞传代）贴壁生长细

50、胞传代 培养培养2）悬浮生长细胞传代）悬浮生长细胞传代离心法传代离心法传代 直接传代法直接传代法 离心法传代：离心（离心法传代：离心（1000转转/分分-800g）去）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除将上清培养液去除l2一一23，然后用，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。（三）细胞纯化（三）细胞纯化（四）细胞的冻存复苏（四）细胞的冻存复苏v细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。1、冻存意义：、冻存意义