分子遗传图谱构建.ppt

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1、第三章 分子图谱的构建 分子图谱构建的步骤：1.选择适合作图的DNA标记；2.根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用于建立作图群体的亲本组合；3.建立具有大量DNA标记处于分离状态的分离群体或衍生系；4.测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型；5.对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。第一节第一节 作图群体的建立作图群体的建立要构建DNA标记连锁图谱，必须建立作图群体。建立作图群体需要考虑的重要因素包括亲本的选配、分离群体类型的选择及群体大小的确定等。一、亲本的选配一、亲本的选配首先要考虑亲本间的DNA多态性。选择亲本时应尽量选用纯度高的材料，并进一步通过自交进行纯化。要考虑杂交后代

2、的可育性。选配亲本时还应对亲本及其F1杂种进行细胞学鉴定。二、分离群体类型的选择二、分离群体类型的选择根据其遗传稳定性可将分离群体分成两大类：一类称为暂时性分离群体，如F2、F3、F4、BC、三交群体等，这类群体中分离单位是个体，一经自交或近交其遗传组成就会发生变化，无法永久使用。另一类称为永久性分离群体，如RI、DH群体等，这类群体中分离单位是株系，不同株系之间存在基因型的差异，而株系内个体间的基因型是相同且纯合的，是自交不分离的。这类群体可通过自交或近交繁殖后代，而不会改变群体的遗传组成，可以永久使用。（一）（一）F2代群体代群体优点：优点：a)自花授粉植物，还是异花授粉植物，建立自花授粉

3、植物，还是异花授粉植物，建立F2群群体都是容易的体都是容易的。缺点：a)存在杂合基因型。对于显性标记，将无法识别显性纯合基因型和杂合基因型。b)由于这种基因型信息简并现象的存在，会降低作图的精度。c)为了提高精度，减小误差，则必须使用较大的群体，从而会增加DNA标记分析的费用。d)不易长期保存，有性繁殖一代后，群体的遗传结构就会发生变化。（二）（二）BC1群体群体优点：优点：a)BC1群体中每一分离的基因座只有两种基因型，群体中每一分离的基因座只有两种基因型，它直接反映了它直接反映了F1代配子的分离比例代配子的分离比例。b)可以用来检验雌、雄配子在基因间的重组率上是否存在差异。c)缺点：d)不

4、能长期保存。e)对于一些人工杂交比较困难的植物，BC1群体也不太合适，因为一是难以建立较大的BC1群体，二是容易出现假杂种，造成作图的误差。（三）（三）RI群体群体RI（重组自交系）群体是杂种后代经过多代（重组自交系）群体是杂种后代经过多代自交而产生的一种作图群体，通常从自交而产生的一种作图群体，通常从F2代代开始，采用单粒传的方法来建立。开始，采用单粒传的方法来建立。优点：可以长期使用，可以进行重复试验。优点：可以长期使用，可以进行重复试验。缺点：缺点：a)构建RI群体要花费很长时间 b)异花授粉植物由于存在自交衰退和不结实现象，建立RI群体也比较困难。（四）（四）DH群体群体高等植物的单倍

5、体（高等植物的单倍体（Haploid）是含有配子染色体）是含有配子染色体数的个体。单倍体经过染色体加倍形成的二倍体数的个体。单倍体经过染色体加倍形成的二倍体称为加倍单倍体或双单倍体（称为加倍单倍体或双单倍体（DH）。）。优点：优点：a)DH植株是纯合的，自交后即产生纯系，因此DH群体可以稳定繁殖，长期使用，是一种永久性群体。b)DH群体的遗传结构直接反映了F1配子中基因的分离和重组，因此DH群体与BC1群体一样，作图效率是最高的。c)DH群体跟RI群体一样，可以反复使用，重复试验，因此也特别适合于QTL定位的研究。缺点：a)有些植物的花药培养非常困难，就无法通过花培来建立DH群体。b)植物的花

6、培能力跟基因型关系较大，因而花培过程会对不同基因型的花粉产生选择效应，从而破坏DH群体的遗传结构，造成较严重的偏分离现象，这会影响遗传作图的准确性。三、群体大小的确定三、群体大小的确定 遗传图谱的分辨率和精度，很大程度上取决于群体大小。群体越大，则作图精度越高。但群体太大，不仅增大实验工作量，而且增加费用。因此确定合适的群体大小是十分必要的。一，合适群体大小的确定与作图的内容有关。从作图效率考虑，作图群体所需样本容量的大小取决于以下两个方面：是从随机分离结果可以辨别的最大图距。是两个标记间可以检测到重组的最小图距。二，作图群体大小还取决于所用群体的类型。在分子标记连锁图的构建方面，为了达到彼此

7、相当的作图精度，所需的群体大小的顺序为F2RIBC1和DH。第二节第二节 图谱构建的理论基础图谱构建的理论基础一、染色体遗传理论一、染色体遗传理论 1903年W.S.Sutton和T.Boveri分别提出了遗传因子位于染色体上的理论，他们将染色体看作是孟德尔基因的物理载体。该理论亦称为Sutton-Boveri染色体遗传理论：(1)体细胞核内的染色体成对存在，其中一条来自雌亲，一条来自雄亲，成对染色体的两个成员是同源的。(2)每条染色体在个体的生命周期中均能保持其结构上的恒定性和遗传上的连续性，因而在个体的发育过程中起着一定的作用。(3)在减数分裂中，同源染色体的两个成员相互配对，随后又发生分

8、离，走向细胞的两极，从而形成两个单倍体性细胞。二、基因重组和连锁理论二、基因重组和连锁理论 连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换与重组。与重组。基因的连锁是位于同一染色体上的基因在遗传过程中一般倾向于维系在一起。基因的重组是通过一对同源染色体的两个非姊妹染色单体之间的交换来实现的。假设某一对同源染色体上存在Sh-sh，C-c两对连锁基因，现有两个亲本P1 和P2，它们的基因型分别为ShShCC和shshcc，两亲本杂交产生ShshCc双杂合体。F1在减数分裂过程中应产生4种类型的配子，其中两种为亲型配子ShC和shc，两种为重组型配子Shc和shC。由于Sh

9、-sh和C-c位于同一染色体上，要产生重组型配子必须在这两个基因的连锁区段上发生交换。Sh Csh c二二分分体体Sh CSh CSh CSh CSh Csh csh csh csh csh csh CSh cC ShC ShC Shc ShC shc shc shc sh四四分分体体全部亲组合占全部亲组合占943亲组合亲组合 3重组合重组合6%细胞交换F1新新新sh csh cSh CSh CP1P294细胞无交换重组型配子所占的比例取决于减数分裂细胞中发生交换的频率。交换频率越高，则重组型配子的比例越大。重组型配子最大可能的比例是50%，这时在所有减数分裂的细胞中，在两对基因的连锁区段上都

10、发生交换，相当于这两对基因间无连锁，表现为独立遗传。重组型配子占总配子的比例称为重组率，用r表示。重组率的高低取决于交换的频率，而两对基因之间的交换频率取决于它们之间的直线距离。重组率的值变化于完全连锁时的0%到完全独立时的50%之间。因此重组率可用来表示基因间的遗传图距，图距单位用厘摩（centi-Morgan，cM）表示，1cM的大小大致符合1%的重组率。三、图谱制作的统计学原理三、图谱制作的统计学原理（一）两点测验（一）两点测验 如果两个基因座位于同一染色体上且相距较近，则在分离后代中通常表现为如果两个基因座位于同一染色体上且相距较近，则在分离后代中通常表现为连锁遗传。对两个基因座之间的

11、连锁关系进行检测，称为连锁遗传。对两个基因座之间的连锁关系进行检测，称为两点测验两点测验。了解各基因座位的等位基因分离是否符合孟德尔分离比例，这是连锁检验的前提：在共显性条件下，F2群体中一个座位上的基因型分离比例为1:2:1，而BC1和DH群体中分离比例均为1:1；在显性条件下，F2群体中分离比例为3:1，而BC1和DH群体中分离比例仍为1:1。检验DNA标记的分离是否偏离孟德尔比例，一般采用2检验。两个连锁座位不同基因型出现的频率是估算重组值的基础：在一般的遗传学教材中，重组值的估计是根据分离群体中重组型个体占总个体的比例来估计的。这种估计方法无法得到估计值的标准误，因而无法对估值进行显著

12、性检验和置信区间估计。采用最大似然法进行重组率的估计可解决这一问题。最大似然法以满足其估计值在观察结果中出现的概率最大为条件。在人类遗传学研究中，由于通常不知道父母的基因型或父母中标记基因的连锁相是相斥还是相引，因而无法简单地通过计算重组体出现的频率来进行连锁分析，而必须通过适当的统计模型来估算重组率，并采用似然比检验的方法来推断连锁是否存在，即比较假设两座位间存在连锁（r 3；要否定两对基因连锁的存在，则要求似然比小于100:1，即LOD2。在其它生物遗传图谱的构建中，似然比的概念也用来反映重组率估值的可靠性程度或作为连锁是否真实存在的一种判断尺度。（二）多点测验（二）多点测验 对多个座位进

13、行联合分析，利用多个座位间的共分离信息来确定它们对多个座位进行联合分析，利用多个座位间的共分离信息来确定它们的排列顺序，也就是的排列顺序，也就是多点测验多点测验。在未知各基因座位于哪条染色体的情况下：两点测验，根据两点测验的结果，将那些基因座分成不同的连锁群，然后再对各连锁群（染色体）上的座位进行多点连锁分析。在一条染色体上，经过多次多点测验，就能确定出最佳的基因排列顺序，并估计出相邻基因间的遗传图距，从而构建出相应的连锁图。（三）交换干扰与作图函数（三）交换干扰与作图函数 随着间距的增加，两个基因座之间便可能在两处同时发生遗传物质的交换，即双交换。在染色体某区段上发生的双交换，其实际频率往往

14、少于由单交换概率相乘所估得的理论值。这是因为一个位置上所发生的交换会减少其周围另一个单交换的发生，这种现象称为交叉干扰。干扰的程度可用符合系数C表示，符合系数C为实际双交换值与理论双交换值的比值。理论双交换值是指两个相邻的单交换同时独立发生的概率。其中r1和r2分别为两个相邻染色体区段发生单交换的概率。符合系数C的值变动于01之间。当C=0时，表示完全干扰，没有双交换发生；当C=1时，表示没有干扰，两单交换独立发生。一般而言，两单交换的位置相距越远，则彼此干扰的程度就越低，符合系数就越大。作图函数：作图函数：要计算两个相距较远的基因座之间的图距要计算两个相距较远的基因座之间的图距时，如果中间没

15、有其它基因座可利用，则时，如果中间没有其它基因座可利用，则两个基因座之间实际发生的双交换就不能两个基因座之间实际发生的双交换就不能被鉴别出来，因此，采用一些数学方法进被鉴别出来，因此，采用一些数学方法进行矫正是必要的，否则，从重组率估计出行矫正是必要的，否则，从重组率估计出的图距就会比真实图距小。这种矫正可通的图距就会比真实图距小。这种矫正可通过作图函数来实现。过作图函数来实现。1，在C=1的假定下，图距x与重组率r之间的关系服从Haldane作图函数：x=-（1/2）ln（1-2r）其中x以M为单位。这里M读作Morgan（摩尔根），它是用著名遗传学家摩尔根的姓命名的，并取第一个字母表示1M

16、=100cM（厘摩），1cM为一个遗传单位，即1%的重组率。根据Haldane作图函数，20%的重组率相当于图距为 -（1/2）ln（1-20.20）=0.255M，即25.5cM。Haldane作图函数的不合理之处在于假定了完全没有交叉干扰。2，为了将交叉干扰的因素考虑进去，一种比较合理的假设是，双交换符合系数与重组率之间存在线性关系，即C=2r。该式表示，C值随r的增加而增加，干扰相应减弱。当r=0.5（即没有连锁）时，C=1（即没有干扰）。根据这一假设推导出了如下作图函数（Kosambi作图函数）：根据上式可以算出，当r=0.2时，x=21.2cM。可见Kosambi作图函数算出的图距比

17、Haldane作图函数的小。由于Kosambi作图函数比Haldane作图函数更合理，因此它在遗传学研究中得到了更广泛的应用。第三节第三节 DNA标记分离数据的数学处理标记分离数据的数学处理一、分离数据的收集与数字化一、分离数据的收集与数字化 从分离群体中收集分子标记的分离数据，获得不同个体的DNA多态性信息，是进行遗传连锁分析的第一步。通常各种DNA标记基因型的表现形式是电泳带型，将电泳带型数字化是DNA标记分离数据进行数学处理的关键。a)假设某个RFLP座位在两个亲本（P1,P2）中各显示一条带，由于RFLP是共显性的，则F1个体中将表现出两条带，而F2群体中不同个体的带型有三种，即P1型

18、、P2型和F1（杂合体）型。例如，将P1带型记为1，P2带型记为3，F1带型记为2。如果带型模糊不清或由于其它原因使数据缺失，则可记为0。b)如果存在显性标记，则F2中还会出现两种情况：一种是P1对P2显性，于是P1型和F1型无法区分，这时应将P1型和F1型作为一种类型，记为4。另一种情况正好相反，P2对P1显性，无法区分P2型和F1型，故应将它们合为一种类型，记为5。c)对于BC1、DH和RI群体，每个分离的基因座都只有两种基因型，不论是共显性标记还是显性标记，两种基因型都可以识别，加上缺失数据的情况，总共只有3种类型。因而用3个数字就可以将标记全部带型数字化。DNA标记数据的收集和处理应注

19、意以下问题：（1）应避免利用没有把握的数据。（2）应注意亲本基因型，对亲本基因型的赋值（如P1型为1，P2型为2），在所有的标记座位上必须统一，千万别混淆。（3）当两亲本出现多条带的差异时，应通过共分离分析鉴别这些带是属于同一座位还是分别属于不同座位。如属于不同座位，应逐带记录分离数据。二、遗传图距与物理距离对应关系的估计二、遗传图距与物理距离对应关系的估计：不同生物的1cM图距所对应的实际物理距离（碱基对数量）存在很大差异。一般而言，生物越低等或越简单，1cM图距平均对应的碱基对数量就越少（表3.1）。表3.1中给出的各种生物中遗传图距与物理距离之间的对应关系只是一个大约的平均值，实际上它变

20、化很大。在一条染色体上，由于不同区域上发生交换的频率存在差异，因而遗传图距与物理距离之间的对应关系可以有很大的变化。例如，在着丝粒附近，染色体交换受到抑制，因而所估计的遗传图距小于平均对应的物理距离。在同一种生物中，两个特定基因座之间的遗传图距会因遗传背景的不同而改变，甚至有时由同一对亲本所产生的遗传背景相同的不同群体间也存在很大差异。三、构建三、构建DNA标记图谱的计算机软件标记图谱的计算机软件许多学者为构建遗传图谱设计了专用程序包,通过Internet网址http:/可以获得各种专用程序的相关信息，如软件的名称及简要介绍，源程序编码语言、支持的操作系统、执行程序的名称、参考文献以及获取软件

21、的网址等。应用于植物遗传连锁分析和遗传图谱构建的常用软件有LINKAGE、MAPMAKER/EXP等。LINKAGE软件可通过ftp:/software/linkage 获得，该软件是利用最大似然法估计两座位或多座位间的重组率和LOD值；MAPMAKER/EXP可通过ftp:/ftp-bution/software/mapmaker3获得，该软件可以应用于各种类型的实验群体进行遗传作图，是目前应用最为广泛的作图软件之一。第四节 DNA标记连锁图谱的完善 一、一、DNA标记连锁群的染色体定位标记连锁群的染色体定位 把分子标记所建立的连锁群与经典遗传图谱联系起来，并将其归属到把分子标记所建立的连锁

22、群与经典遗传图谱联系起来，并将其归属到相应的染色体上，是构建了一个比较饱和的分子图谱之后十分重要的相应的染色体上，是构建了一个比较饱和的分子图谱之后十分重要的工作。通常根据分子标记与已知染色体位置的形态标记的连锁关系来工作。通常根据分子标记与已知染色体位置的形态标记的连锁关系来确定分子标记连锁群属于哪条染色体。还可以利用非整倍体或染色体确定分子标记连锁群属于哪条染色体。还可以利用非整倍体或染色体结构变异材料，如水稻中利用三体、玉米中利用结构变异材料，如水稻中利用三体、玉米中利用A/B易位系、小麦中易位系、小麦中利用缺体利用缺体/四体染色体代换系等，将分子标记连锁群归属到相应的染四体染色体代换系

23、等，将分子标记连锁群归属到相应的染色体上。色体上。随着技术的进步，随着技术的进步，原位分子杂交原位分子杂交的灵敏度已可以揭示单拷贝序列的杂的灵敏度已可以揭示单拷贝序列的杂交位点，因此采用原位分子杂交可以容易地将连锁群的分子标记定位交位点，因此采用原位分子杂交可以容易地将连锁群的分子标记定位到染色体上。到染色体上。一个完整的遗传图谱，必须知道染色体上的标记与一个完整的遗传图谱，必须知道染色体上的标记与着丝粒之间的距离。一个完整的染色体具有以下着丝粒之间的距离。一个完整的染色体具有以下几个主要部分：着丝粒、缢痕、随体及端粒几个主要部分：着丝粒、缢痕、随体及端粒。在经典遗传图谱的构建中，一般采用近端

24、着丝粒染色体来对基因与着丝之间的距离进行定位。染色体上的端粒是指染色体的自然末端。近端着丝粒染色体是正常染色体在着丝粒附近断裂形成的异常染色体。在遗传图谱的构建中，端粒位置的确定就意味着为染色体的全长设定界标。传统的凝胶电泳方法由于分辨能力有限，大多数情况下无法将具有多态性的端粒片段区分开来。一般要借助具有高分辨率的脉冲场凝胶电泳（PFGE）才能将有差异的端粒片段分离开来。二、饱和DNA标记连锁图的制作遗传图谱饱和度是指单位长度染色体上已定位的标记数或标记在染色体上的密度。一个基本的染色体连锁框架图大概要求在染色体上的标记平均间隔不大于20cM。研究了所需标记数与图谱饱和度之间的关系，发现影响

25、所需标记数的主要因素有两个：一个是标记间的平均距离，即图谱总长度除以定位的标记数，它反映了标记图谱的平均密度。另一个因素是标记间的最大距离。通过提高图谱平均密度的方法来缩小最大标记间距是很困难的。在实际研究中，为了填补间隙，应有针对性地在间隙区上寻找标记，或寻找该间隙所在区域上有差异的亲本构建作图群体，利用特性上互补的不同DNA标记进行遗传作图，将有助于提高遗传图谱的饱和度。三、三、DNA标记连锁图与经典遗传连锁图的整合标记连锁图与经典遗传连锁图的整合为了充分利用现有的分子和遗传的信息，必须将分为了充分利用现有的分子和遗传的信息，必须将分子遗传图谱与经典遗传图谱结合起来，成为一张综子遗传图谱与

26、经典遗传图谱结合起来，成为一张综合的遗传图谱。将两类遗传标记综合到一张遗传图合的遗传图谱。将两类遗传标记综合到一张遗传图谱中去，不仅是重要经济性状准确定位的需要，也谱中去，不仅是重要经济性状准确定位的需要，也是以图位克隆方法分离目的基因的需要。是以图位克隆方法分离目的基因的需要。分子图谱与经典图谱的整合只能通过将传统的遗传分子图谱与经典图谱的整合只能通过将传统的遗传标记基因一个一个地定位到分子图谱中去的策略来标记基因一个一个地定位到分子图谱中去的策略来进行。为此，可以选择各种传统的遗传标记材料来进行。为此，可以选择各种传统的遗传标记材料来建立作图群体，并用适当的方法快速地找到与传统建立作图群体

27、，并用适当的方法快速地找到与传统的遗传标记紧密连锁的分子标记，再根据分子标记的遗传标记紧密连锁的分子标记，再根据分子标记在分子图谱上的位置来确定传统遗传标记的位置。在分子图谱上的位置来确定传统遗传标记的位置。第五节第五节 比较作图比较作图比较作图（Comparative Mapping）就是利用一种物种的DNA标记对另一物种进行遗传或物理作图。比较作图的分子基础就是物种间DNA序列尤其是编码序列的保守性。通过比较作图可揭示不同物种基因组或基因组区域同线性或共线性的存在，从而了解不同物种基因组结构的相似性及基因组进化的历程。同线性是指定位在一个物种的染色体上的两个或多个标记又被定位于另一物种的同

28、源染色体区域上，但这些标记间的相对排列顺序可变化。共线性则指定位在同源染色体区域上的标记，其标记间的相对排列顺序是保守的。比较作图始于人-鼠间的基因组同源性比较。至今许多植物之间也进行了比较作图研究，如番茄、马铃薯和辣椒(Tanksley et al.1988；1992)；水稻、小麦和玉米(Ahn et al.1993；1994)；小麦、大麦和黑麦(Devos et al.1993)；高粱和玉米(Pereira et al.1994)；拟南芥和芸苔属(Kowalski et al.1994)大麦和水稻(Maroof et al.1996)等。Moor等(1995)对水稻、小麦、玉米、谷子、甘蔗

29、及高粱等6种主要禾本科物种的比较作图研究表明，这些禾本科植物基因组的保守性可归结到水稻基因组的19个连锁区段上，由这19个区段可实现对所研究的全部禾谷类作物进行染色体的重建，并可构成一个禾谷类作物祖先种的染色体骨架。可见，比较作图研究已使得传统的植物遗传学突破了物种的框架限制，发展成了新的统一遗传学。通过比较作图的研究：a)可显著增加各种物种中可供利用的遗传标记的数量，这对遗传研究较为滞后的物种来说显得十分重要。b)根据已定位在某个物种中的新基因，在其它近缘物种的染色体同源区域定位相同的基因，这将大大提高基因定位的效率。随着某些物种的基因组全序列的测序完成，比较作图研究也将随之进入一个新的时代，即可直接在核苷酸序列水平上对不同物种的基因组进行比较分析，从而对生物的遗传本质达到更深刻的了解。