分子生物学改造.ppt

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1、蛋白质分子的生物学改造蛋白质分子的生物学改造v蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工蛋白质在生命现象中具有重要作用，在医药、轻工等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白等行业也具有重要作用，如胰岛素、枯草杆菌蛋白酶等；酶等；v天然生物材料中蛋白质含量较少；天然生物材料中蛋白质含量较少；v基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定基因克隆技术克隆基因，在宿主细胞中可表达特定蛋白质（重组蛋白）；蛋白质（重组蛋白）；v多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途多数天然蛋白质的理化特性不能适应于工业用途;v利用现代利用现代分子生物学技术分子生物学技术，改变克隆基因中的特定，改变克隆基因中的

2、特定基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。基因，即可表达出适合于商业用途的蛋白质。v在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，在体外，通过碱基取代、插入或缺失的方法，使基因使基因DNA序列中的某个特定碱基发生改变，序列中的某个特定碱基发生改变，从而改变蛋白质的结构，称为从而改变蛋白质的结构，称为蛋白质工程。蛋白质工程。v通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变通过蛋白质工程，人们可以随心所欲地改变蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。蛋白质的结构及其理化性质和生物学功能。例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的例如，我们可以利用蛋白质工程改变酶的Km、Vmax，酶促反应的最适温度、最适，酶促反应的最

3、适温度、最适pH值、值、酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。酶促反应的特异性以及酶蛋白的稳定性等。v蛋白质工程的主要技术之一是蛋白质工程的主要技术之一是定点突变技术定点突变技术.一、定点突变一、定点突变v利用分子生物学技术，在体外通过利用分子生物学技术，在体外通过碱基取代、插入碱基取代、插入或缺失或缺失可以使基因可以使基因DNA序列中任何一个序列中任何一个特定的碱基特定的碱基发生改变发生改变。这种体外特异性改变某个碱基的技术，。这种体外特异性改变某个碱基的技术，称谓称谓定点突变（定点突变（sitedirectedmutagenesis）。）。v定点突变定点突变具有简单易行、重复性高等优点，现

4、已发具有简单易行、重复性高等优点，现已发展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于展成为基因操作的一种技术。这种技术不仅适用于基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码基因结构与功能的研究，还可通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质。子来改造天然蛋白质。二、基因定点突变的意义二、基因定点突变的意义v用于研究基因的结构与功能；用于研究基因的结构与功能；v通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，通过改变基因的密码子来改造天然蛋白质，使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以使其更符合人们的需要。如酶蛋白的改造以及新型疫苗或药物的开发。及新型疫苗或药物的开发。v如枯草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是如枯

5、草杆菌蛋白酶之所以易被氧化失活，是由于催化部位的由于催化部位的丝氨酸丝氨酸(Ser221)邻近的邻近的甲硫甲硫氨酸氨酸(Met222)易被氧化成硫氢化物，若以其易被氧化成硫氢化物，若以其他氨基酸取代他氨基酸取代Met222，则可提高酶的氧化稳，则可提高酶的氧化稳定性而又不影响其催化活性。这是结构分析定性而又不影响其催化活性。这是结构分析和定点突变改造蛋白质的成功范例。和定点突变改造蛋白质的成功范例。v枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其枯草杆菌蛋白酶可作为洗涤剂的添加剂，但由于其只能水解只能水解苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)羧基羧基所形成的肽键，底物作所形成的肽键，底物作用范围过窄而限制了

6、洗涤剂的高效性，若用带正电用范围过窄而限制了洗涤剂的高效性，若用带正电荷的荷的赖氨酸赖氨酸(Lys)取代位于活性中心取代位于活性中心166位的位的甘氨酸甘氨酸(Gly)，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸，所获得的突变酶不仅能水解苯丙氨酸(Phe)羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸羧基所形成的肽键，而且可以水解酸性氨基酸谷氨谷氨酸酸(Glu)所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因所形成的肽键，使其底物作用范围拓宽，因而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点突变而可能成为最高效的洗涤剂添加酶，这是定点突变改变蛋白质生物学活性的成功例子。改变蛋白质生物学活性的成功例子。加入二硫键增加蛋白质的稳

7、定性加入二硫键增加蛋白质的稳定性v蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基蛋白质分子中两个半胱氨酸残基上的巯基（SH）之间氧化脱氢即形成二硫键（）之间氧化脱氢即形成二硫键（）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性）。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。酸碱稳定性。v在一项研究中，通过寡核苷酸定点突变构建在一项研究中，通过寡核苷酸定点突变构建了了T4溶菌酶的六种变异体溶菌酶的六种变异体,比较了它们的活性比较了它们的活性.vT4溶菌酶和溶菌酶和6种设计的变

8、体特性种设计的变体特性v酶酶氨基酸的位置氨基酸的位置二硫键的数目二硫键的数目相对活性相对活性Tmv39215497142164(%)()vwtIleIleThrCysCysThrLeu010041.9vpwtIleIleThrThrAlaThrLeu010041.9vACysIleThrThrCysThrLeu19646.7vBIleCysThrThrAlaThrCys110648.3vCIleIleCysThrAlaCysLeu1052.9vDCysCysThrThrCysThrCys29557.6vEIleCysCysThrAlaCysCys2058.9vFCysCysCysThrCysC

9、ysCys3065.9vwt：野生型：野生型T4溶菌酶；溶菌酶；pwt:假野生型酶；假野生型酶；AF：六种设计的半胱氨酸：六种设计的半胱氨酸变体；变体；Tm:熔点温度熔点温度将将Asn和和Gln转换成其他氨基酸转换成其他氨基酸v当蛋白质暴露于高温时当蛋白质暴露于高温时:v天冬酰胺（天冬酰胺（Asn）天冬氨酸天冬氨酸(Asp)+NH3v谷氨酰胺谷氨酰胺(Gln)谷氨酸谷氨酸(Glu)+NH3v导致肽链折叠的局部的改变导致肽链折叠的局部的改变,可能影响其活性。可能影响其活性。v如酵母的如酵母的丙糖磷酸异构酶丙糖磷酸异构酶是由两个相同的亚基组成的二聚体，是由两个相同的亚基组成的二聚体，每个亚基都含有

10、两个每个亚基都含有两个Asn残基，均位于两个亚基相互接触的残基，均位于两个亚基相互接触的表面上，可能与该酶的热稳定性有关。表面上，可能与该酶的热稳定性有关。v若将两个若将两个Asn全部换成全部换成Asp，则变体酶即使在常温下也不稳，则变体酶即使在常温下也不稳定，而且酶活性也大为降低；定，而且酶活性也大为降低；v而将而将2个个Asn分别换为分别换为苏氨酸苏氨酸(Thr)和和异亮氨酸异亮氨酸(Ile)，其半衰，其半衰期则延长。期则延长。v酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性酵母菌磷酸丙糖异构酶及其变体的热稳定性v氨基酸位点氨基酸位点v酶酶1478半衰期（半衰期（min）v野生型野生型AsnAsn

11、13v变体变体AAsnThr17v变体变体BAsnIle16v变体变体CThrIle25v变体变体DAspAsn11v酶的稳定性以在酶的稳定性以在100时半衰期或者失活率来表示。时半衰期或者失活率来表示。半衰期越长酶越稳定半衰期越长酶越稳定减少游离减少游离Cys残基的数目残基的数目v在利用在利用DNA重组技术表达外源基因时，常常重组技术表达外源基因时，常常会遇到这种情况：外源蛋白的表达量很大，会遇到这种情况：外源蛋白的表达量很大，但其生物活性却很低，即外源蛋白的但其生物活性却很低，即外源蛋白的比活性比活性很低。很低。v利用蛋白质工程技术减少游离的半胱氨酸利用蛋白质工程技术减少游离的半胱氨酸（C

12、ys）残基数目，以减少蛋白错误折叠的）残基数目，以减少蛋白错误折叠的可能性，从而可以提高蛋白质的生物活性。可能性，从而可以提高蛋白质的生物活性。v例如：例如：当人当人-干扰素基因（干扰素基因（-IFN）在大肠杆菌中表）在大肠杆菌中表达时，尽管其表达量很高，但其比活性只及天然蛋达时，尽管其表达量很高，但其比活性只及天然蛋白质的白质的10%。vDNA序列分析显示，序列分析显示，-IFN所编码的蛋白质有三个所编码的蛋白质有三个Cys残基，其中残基，其中2个形成分子内个形成分子内二硫键，二硫键，而另一个游而另一个游离的离的Cys可能涉及到可能涉及到-IFN分子间分子间二硫键二硫键的形成，导的形成，导致

13、二聚体的产生，使单聚体含量减少，活性降底。致二聚体的产生，使单聚体含量减少，活性降底。v将将-IFN分子中的游离分子中的游离Cys残基用残基用Ser来取代，因为来取代，因为Cys与与Ser分子结构相似，前者有一个分子结构相似，前者有一个S原子，而后原子，而后者是一个者是一个O原子，减少了二聚体的形成，提高了活原子，减少了二聚体的形成，提高了活性蛋白质的得率。性蛋白质的得率。增加酶的活性增加酶的活性v用定点突变技术不仅可以提高蛋白质的稳定用定点突变技术不仅可以提高蛋白质的稳定性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性，性，还可以提高酶的活性。要改变酶的活性，需要一个详细描述了酶的活性位点的图谱。需要

14、一个详细描述了酶的活性位点的图谱。有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底有了这样的资料，研究者们即可推测酶与底物的亲和程度，并利用定点突变技术对蛋白物的亲和程度，并利用定点突变技术对蛋白质进行改造，提高酶的活性。质进行改造，提高酶的活性。v天然和突变酪氨酰天然和突变酪氨酰-tRNA合成酶活性合成酶活性v酶Kcat(s-1)Km(mmol/L)Kcat/Km(s-1mol-1)vThr-514.72.51.860vAla-514.01.23.200vPro-511.80.01995.800改变酶的特异性改变酶的特异性突变葡萄球菌核酸酶与含突变葡萄球菌核酸酶与含-SH寡核苷酸结合示意图寡核苷酸结合

15、示意图三、定点突变原理三、定点突变原理（一）（一）M13DNA寡核苷酸突变寡核苷酸突变v基因工程中基因工程中,噬菌体噬菌体是一种常用的基因载体是一种常用的基因载体,其中又以其中又以M13M13和和为最常用。为最常用。vM13噬菌体是一种环形噬菌体是一种环形DNA，基因组大小为，基因组大小为6.4kb，在颗粒，在颗粒中包装的仅是中包装的仅是正链的正链的DNA，有时也称为，有时也称为感染型单链感染型单链DNA(singlestrandedDNA,ssDNA)。v当感染型单链当感染型单链M13噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿噬菌体感染大肠杆菌后，在菌体内借助宿主的酶系统先把主的酶系统先把ssDN

16、A复制为双链（复制为双链（dsDNA），称为），称为复制复制型（型（replicationform,RF）M13（RF-M13）。v广泛用于广泛用于DNA序列分析和噬菌体表面展示系统（序列分析和噬菌体表面展示系统（phagedisplay)和单链核酸的制备和单链核酸的制备。四、定点突变的常用方法1.基本原理基本原理v再使用化学合成的再使用化学合成的含有突变碱基含有突变碱基的寡核苷酸短片段的寡核苷酸短片段作引物，启动作引物，启动M13单链单链DNA分子进行复制，随后这分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为新合成的段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组子链的一个组成部分。成部分。v因此所

17、产生的新链便具有已发生突变的碱基序列因此所产生的新链便具有已发生突变的碱基序列,将将其转入细胞后其转入细胞后,经过不断复制经过不断复制,即可获得突变的即可获得突变的DNA分子分子,再经表达即可获得改造后蛋白质再经表达即可获得改造后蛋白质.v为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。则与目的基因编码链的特定区段完全互补。2.突变过程突变过程1)合成含有目的合成含有目的基因的正链基因的正链DNA；2)合成含有特殊合成含有特殊突变

18、碱基的引物；突变碱基的引物；3）制备异源双链）制备异源双链DNA；4）富集和转化双）富集和转化双链链DNA分子；分子；5）筛选突变体并鉴定）筛选突变体并鉴定（二）（二）Kunkel定点突变法定点突变法v体外体外DNA合成往往是不完全的，所以部分合合成往往是不完全的，所以部分合成的成的DNA分子必须通过蔗糖密度梯度离心除分子必须通过蔗糖密度梯度离心除去去,获得纯化的突变获得纯化的突变DNA。v理论上来说，理论上来说，DNA是半保留复制的，应用寡是半保留复制的，应用寡核苷酸定点突变时，所形成的噬菌体中携带核苷酸定点突变时，所形成的噬菌体中携带突变基因的应为一半。但实际上，由于技术突变基因的应为一半

19、。但实际上，由于技术上的原因通常只有上的原因通常只有1-5%的噬菌斑含有突变基的噬菌斑含有突变基因的噬菌体。因的噬菌体。具体步骤：具体步骤：将待突变的基因克隆入将待突变的基因克隆入M13 DNA载体上，导入具有载体上，导入具有dUTP酶酶（dut）和）和N-尿嘧啶脱糖苷酶尿嘧啶脱糖苷酶（ung）双缺陷的大肠杆菌）双缺陷的大肠杆菌（dut-，ung-）菌株）菌株中。中。Dut缺陷缺陷导致细胞内导致细胞内dUTP水平水平上升上升，并在，并在DNA复制时，部分复制时，部分取代取代dTTP进入进入DNA新生链中。新生链中。又由于又由于ung缺陷缺陷使掺入使掺入DNA的的dUTP残基不能除去残基不能除去

20、。由这种大。由这种大肠杆菌菌株产生的肠杆菌菌株产生的M13单链单链DNA大约有大约有1%的的T被被U所取代所取代，然后进行然后进行DNA定点突变。定点突变。双链双链DNA导入正常的大肠杆菌导入正常的大肠杆菌中，其尿嘧啶中，其尿嘧啶N-糖基化酶除去糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基。链上的尿嘧啶碱基。结果原来的结果原来的M13模板链被降解，模板链被降解，只有突变链因不含只有突变链因不含U，被保留下，被保留下来。这种方法产生的来。这种方法产生的M13噬菌体噬菌体中含有突变中含有突变DNA的比例大大增的比例大大增加。加。（三）PCR定点突变vPolymeraseChainReaction（PCR）是

21、一）是一种体外酶促合成特定种体外酶促合成特定DNA片断的技术，是根片断的技术，是根据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化据人类的需要对复杂生命过程的一种简单化的模拟。的模拟。PCR技术的原理是技术的原理是DNA半保留复制。半保留复制。Kari.B.Mullis首创。首创。PCR进行寡核苷酸进行寡核苷酸定点突变的示意图定点突变的示意图1 1、重叠延伸、重叠延伸PCR PCR（OE-PCROE-PCR）首先设计两个首先设计两个PCRPCR反应以产生两个含反应以产生两个含突变位点的突变位点的DNADNA片段，随后将上述两个片段，随后将上述两个PCRPCR产物混合，二者通过产物混合，二者通过末端互补区

22、结合末端互补区结合并在适宜的温度下并在适宜的温度下互为引物延伸互为引物延伸得到完得到完整的含突变的基因，对第一次整的含突变的基因，对第一次PCRPCR产物进产物进行纯化处理可显著提高突变效率行纯化处理可显著提高突变效率2 2、大引物、大引物PCRPCR法法（megaprimer PCR)megaprimer PCR)先设置一个先设置一个PCRPCR反应产生一个含突变的反应产生一个含突变的DNADNA片段，然后再以此片段，然后再以此DNADNA片段作为引物与原模板片段作为引物与原模板退火进行退火进行PCRPCR扩增得到含突变的完整的基因。扩增得到含突变的完整的基因。因为作为引物使用的因为作为引物

23、使用的DNADNA片段较通常的引物要片段较通常的引物要大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物PCRPCR法。法。大引物大引物PCR PCR 定点突变技术路线定点突变技术路线（圆点指突变位点）（圆点指突变位点）3 3、环状突变、环状突变 PCR PCR 法法定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用突变剂定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用突变剂进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。方法：方法：两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平末端的线性末端的线性DNA

24、DNA，需用，需用T4T4连接酶环化处理。连接酶环化处理。以以StratageneStratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表，公司开发的定点突变试剂盒为代表，两个引物也是反向的并且其两个引物也是反向的并且其55端有端有l5l5个碱基以上的个碱基以上的重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNADNA，可自行，可自行环化。环化。环状突变环状突变 PCR PCR 法法环状突变环状突变 PCR PCR 法法通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性通过特殊氨基酸的改变提高蛋白的稳定性 例：例：葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶（Glucose isomeraseGlucose

25、isomerase）用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点用双引物法对葡萄糖异构酶基因进行了体外定点诱变，以诱变，以Pro138Pro138替代替代Gly138Gly138，在酶比活相近的情况下，在酶比活相近的情况下，突变型葡萄糖异构酶的突变型葡萄糖异构酶的热半衰期比野生型长一倍热半衰期比野生型长一倍，最最适反应温度提高适反应温度提高10121012 C C。据分析，可能由于据分析，可能由于Pro138Pro138替代替代Gly138Gly138引入的一个引入的一个吡咯环刚好能够填充吡咯环刚好能够填充Gly138Gly138附近的空洞，使突变蛋白附近的空洞，使突变蛋白的空间结构更具刚性，从

26、而提高了酶的热稳定性。的空间结构更具刚性，从而提高了酶的热稳定性。通过引入通过引入二硫键二硫键提高蛋白的稳定性提高蛋白的稳定性 蛋白质分子中两个半胱氨酸的巯基之间氧化脱氢即蛋白质分子中两个半胱氨酸的巯基之间氧化脱氢即形成二硫键。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增形成二硫键。二硫键的数量与蛋白质的稳定性有关，增加蛋白质分子中的二硫键，可以提高蛋白质分子的热稳加蛋白质分子中的二硫键，可以提高蛋白质分子的热稳定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。定性、有机溶剂稳定性和酸碱稳定性。通过改变活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性通过改变活性中心附近的氨基酸提高酶的催化活性应用举例：大肠杆菌碱性磷酸酶应用举例

27、：大肠杆菌碱性磷酸酶E.coli Alkaline phosphatase:Mutation of D101SMutation of D101S Wild Type D101SAsp101Ser101二、编码基因二、编码基因随机随机突变和重组突变和重组q易错易错PCR（Error prone PCR）qDNA改组（改组（DNA shuffling）v易错PCR（error-pronePCR）是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率,降低聚合酶固有的突变序列倾向性,提高突变谱的多样性,使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中,从而得到随机突变的DNA群体,最后用合适的载体克

28、隆突变基因。v连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。方法：l增加MgCl2浓度到7mM,稳定非互补的碱基配对l增加聚合酶量到5U,促使在错配碱基处继续延伸反应l降低一种dNTP的量（降至1-10）.在缺乏正确核苷酸时,聚合酶经短暂停留后,会插入另外3种可用核苷酸的一种l加入次黄嘌呤dITP来代替被减少的dNTP,能与C、T、A配对l缓冲液中另加0.5mmol/L MnCl2,Mn2+能降低聚合酶对模板的特异性l增加dCTP和dTTP的浓度到1mM，促进错误掺入l使用突变DNA

29、聚合酶如Mutazyme GCAT易错PCR(epPCR)DNA改组（DNA Shuffling）又称DNA“洗牌”,或DNA体外随机拼接技术,它依赖PCR,又不完全等同于传统的PCR技术,所以,DNA体外随机拼接又称为有性PCR。指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Rebination)。通过改变单个基因(或基因家族，gene family)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。DNA shuffling体外基因突变一般过程如下(1)获得目的基因:选择一组分别具有一系列所需性状的基因序列作为重组的亲本,亲本之间有序列同源性(60%).亲本可以

30、是经随机诱变得到的一组有益突变体,或天然存在的基因家族.常用的有两种方法。n为了增加突变率采用PCR扩增目的基因回收n为了增强保真性，可以采取抽提含有目的基因的质粒，通过酶切回收。(2)基因酶切回收:采用DNase I消化基因DNA得到10-50 bps或100-300 bps的片段，酶切过程中用Mn2+能提高保真性3倍左右。(3)无引物PCR:切割的DNA片段通过相互间的同源随机互补并互为引物,经PCR扩增,获得大量随机组合的新DNA突变体.为确保得到高保真性的片段，应在较高的温度下复性。同标准PCR,先对dsDNA进行热变性,退火时单链片段与足够长度互补序列的其它单链配对,形成3或5突出端

31、,聚合酶延伸3凹端.反复循环，随着循环数增加,片段的平均长度也增加,最后达到DNA亲本序列的原始长度.(4)有引物PCR:将无引物PCR产物作适当稀释，作为模板进行PCR，加入特定两侧引物进行最后的PCR扩增,便可获得全长基因的PCR产物。(5)目的突变基因的获得:回收目的片段克隆到载体上，转化选择所需的突变了的目的基因。如筛选抗性基因、高酶活基因等DNase处理无引物PCR 片段重装配3355355355335533反复循环有引物PCR克隆筛选DNA Shuffling技术能模拟生物的基因在数百万年间发生的分子进化过程，并能在短期的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高成千上万倍的

32、功能性突变基因。项目项目进化速度进化对象进化周期影响对象突变效率常规定向常规定向进化进化缓慢缓慢进化进化整个基因组整个基因组 多年多年完整基因完整基因组组高高DNAShuffling快速快速进化进化特定基因特定基因/操纵子操纵子/病病毒毒几天几天部分基因部分基因组组低低DNA Shuffling与常规定向进化的比较实例:1994年，美国的Stemmer采用单个基因的DNA Shuffling和回交技术，在大肠杆菌中使编码-内酰胺酶的TEM-I基因的抗生素抑制活性(MIC)从0.02ug/mL提高到640ug/mL,即提高了32,000倍。次后，他们又相继选取了绿色荧光蛋白基因(gfp)和-半乳

33、糖昔酶基因(lac)(1997)用DNA Shuffling技术模拟并加速了分子进化过程。筛选获得了酶活性大幅度提高的突变株1996年，Moore等亦采用该技术对降解污水中有机污染物的对硝基苄基酯酶基因进行了定向模拟分子进化研究。1998,Crameri等采用4个不同来源的先锋霉素基因混合进行异源基因组的DNA Shuffling，使单一循环的MIC活性提高了270-540倍。而同时只用单一基因进行的实验仅提高了8倍。交错延伸重组（staggered extension process，StEP）将DNA Shuffling技术进一步改进的DNA体外重组技术核心技术:有性PCR,在一个反应体系

34、中以2个以上有一定序列同源性的DNA片段为模板进行PCR反应,通过变换模板机制实现DNA序列的重新组装交错延伸重组的一般过程如下(1)获得目的基因:选择两个以上有一定序列同源性的分别具有优良性状的亲本基因作为PCR模板n省去用DNase将DNA切割成片段及片段纯化步骤,简化了程序(2)短暂PCR反应 在每轮循环中,退火和延伸反应控制在短暂的时间(5s),引物先在一个模板链上延伸,只能合成出很短的新生链.经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火后继续进行短暂的延伸,此过程反复进行,直到产生全长的基因,得到间隔地含不同模板序列的杂交DNA分子.(3)两端引物PCR:加入两端引物作标准

35、PCR反应,扩增全长的杂交DNA链。(4)目的突变基因的获得:回收目的片段克隆到载体上，从得到的DNA文库中选择或筛选得到性状优化的基因随机引发重组（random-priming rebination，RPR）原理:用一套随机引物与模板配对延伸,产生互补于模板不同位点的短DNA片段混合物,由于碱基的错配和错误引发,这些短的DNA片段中也会有少量点突变,在随后的PCR反应中,这些短的DNA片段互为引物重新组装产生全长的基因模板:一条DNA单链或cDNA随机引发重组的一般过程如下(1)随机引发合成短DNA片段混合物:以变性DNA为模板,加入随机引物,用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段进行延伸反

36、应,得到长短不一的新生DNA片段(50-500bp)(2)过滤、纯化DNA片段混合物 去除模板、长的新生DNA片段、小的新生DNA片段（30bp），蛋白质和引物.(3)无引物PCR.新生DNA片段互为引物,重新组装产生全长的杂交DNA链(4)标准PCR 加入特异的两端引物三、基因融合和基因剪接三、基因融合和基因剪接1 1利用基因融合技术表达外源基因的缘由利用基因融合技术表达外源基因的缘由2 2基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体基因融合的策略与蛋白质分子嵌合体3 3蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接蛋白质内含子介导的蛋白质分子间的连接利用基因融合技术表达外源基因的缘由利用基因融合技术表达外源基因

37、的缘由v外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶外源蛋白通常易被宿主的蛋白水解酶降解降解v通过与特异蛋白质或特异的结构域形成通过与特异蛋白质或特异的结构域形成融合蛋白融合蛋白，利于快，利于快速回收、纯化速回收、纯化v融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白融合蛋白可以体外切割去除融合部分，可以获得天然蛋白v通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在通过与特定的蛋白质形成融合蛋白，可以避免外源蛋白在细胞内形成细胞内形成包涵体包涵体v基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构基因融合是对基因进行改造的手段，广泛用于蛋白质结构功能的研究功能的研究基因融合的策略基因融合的策略将重组基

38、因直接剪接于适当的将重组基因直接剪接于适当的信号肽信号肽之后之后将外源基因本身按将外源基因本身按阅读框架阅读框架自我融合。对一自我融合。对一些小肽的稳定表达、表达产物的活性非常重些小肽的稳定表达、表达产物的活性非常重要要目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的目标蛋白在与其融合的蛋白伙伴序列的C C端端或或N N端融合端融合v为蛋白质的表达和纯化提供方便为蛋白质的表达和纯化提供方便 v研究蛋白质的定位及移动研究蛋白质的定位及移动v控制蛋白质固定的空间取向控制蛋白质固定的空间取向v构建具有双催化活性的融合蛋白或融合酶构建具有双催化活性的融合蛋白或融合酶v防止外源蛋白被宿主的蛋白水解酶降解防止外源蛋白被

39、宿主的蛋白水解酶降解 v改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，改变胞内溶解性：硫氧还蛋白，GSTGSTv蛋白表达的空间定位：信号肽蛋白表达的空间定位：信号肽接头（linker）的设计v长度：过长对蛋白裂解敏感，免疫原性长度：过长对蛋白裂解敏感，免疫原性增加；过短影响蛋白折叠增加；过短影响蛋白折叠v常用非极性的疏水氨基酸：构象广泛，常用非极性的疏水氨基酸：构象广泛，有利于运动；体积小有利于堆积有利于运动；体积小有利于堆积v单链抗体（单链抗体（scFv）生化反应常常需要多酶顺序催化来进行，生化反应常常需要多酶顺序催化来进行，称为顺序酶反应（称为顺序酶反应（Sequence enzyme reaction）。

40、大量的研究表明，通过基因融）。大量的研究表明，通过基因融合构建具有合构建具有双酶活力的融合蛋白双酶活力的融合蛋白，可有效提，可有效提高顺序酶反应的总转化效率。高顺序酶反应的总转化效率。N-terminalN-terminalC-terminalC-terminalFADFAD黑曲霉葡萄糖氧化酶黑曲霉葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)N-terminalN-terminalC-terminalC-terminal曲霉糖化酶曲霉糖化酶(Glucoamylase,GA)GOD subunitGOD subunitGAGAGLG fusion enzymeLinkerpeptide

41、Schematic process of the fusion enzyme formationSchematic process of the fusion enzyme formationTranslated fusion peptide chains Expressed fusion enzyme(Ser-Gly)融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化融合蛋白技术的应用可以使蛋白质的表达与纯化方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段方便地进行。一般来说，将目标蛋白编码基因与一段被称为被称为“亲和尾亲和尾”（Affinity tail）的编码序列相连接，）的编码序列相连接，这段这

42、段“亲和尾亲和尾”可以与亲和层析柱上的配基特异地结可以与亲和层析柱上的配基特异地结合，合，使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地使目标蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。纯化出来。融合蛋白标签 含配体溶液含配体溶液收集目的蛋白收集目的蛋白 洗下未结合的蛋白洗下未结合的蛋白混合蛋白样品混合蛋白样品平衡液平衡液带有配体的树脂带有配体的树脂珠（或胶粒）珠（或胶粒）v融合标签的功能融合标签的功能v蛋白蛋白纯化纯化v蛋白质的蛋白质的检测检测和定向固定和定向固定v体内生物事件的体内生物事件的可视化可视化v提高重组蛋白质的提高重组蛋白质的产量产量v增强重组蛋白质的可溶性及稳定性增强重组蛋白质的

43、可溶性及稳定性融合蛋白融合蛋白报告分子报告分子v将易于检测的蛋白质与目的分子融合表将易于检测的蛋白质与目的分子融合表达，可显示目标分子的存在和定位，广达，可显示目标分子的存在和定位，广泛应用于启动子分析、监控转基因及其泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的表达、细胞的信号转导与药物的筛选筛选 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。其内源发光基团在受到紫外或体内的生物发光蛋白。其内源发光基团在受到紫外或蓝光激发时，可高效发

44、射绿光，且无需底物和辅因子。蓝光激发时，可高效发射绿光，且无需底物和辅因子。GFP可作为一种可作为一种“荧光标签荧光标签”被用来研究目标蛋白的被用来研究目标蛋白的定位及移动情况。定位及移动情况。GFP的不同颜色的不同颜色qGreen-GFPqblue-BFPqCyan-CFPqRed-RFPqYellow-YFP各色荧光蛋白对细菌的标记各色荧光蛋白对细菌的标记vThediversityofgeneticmutationsisillustratedbythisSanDiegobeachscenedrawnwithlivingbacteriaexpressing8differentcolorsof

45、fluorescentproteins.v2008年，科学家将多种色彩的荧年，科学家将多种色彩的荧光蛋白质植入细菌的光蛋白质植入细菌的DNA分子结分子结构中。在细菌体内植入荧光蛋白构中。在细菌体内植入荧光蛋白可以观测这些细菌的生命机理是可以观测这些细菌的生命机理是如何运行的。如何运行的。脑内连接脑内连接v这张图片出自杰夫这张图片出自杰夫利利希曼希曼(JeffLichtman)之手，展现了大脑内之手，展现了大脑内的连接，图片中美丽的连接，图片中美丽的的“彩虹彩虹”就是神经系就是神经系统网络。连线杂统网络。连线杂志网站曾于志网站曾于2007年刊年刊登这张图片。登这张图片。神经干细胞神经干细胞v这张

46、不太拥挤的图像表这张不太拥挤的图像表明明干细胞是如何在空间干细胞是如何在空间排列自己的排列自己的。神经干细。神经干细胞的胞的细胞核细胞核被染为了被染为了绿绿色色，另一种细胞，另一种细胞星星细胞细胞则表现为则表现为红色。红色。荧光鱼荧光鱼v在约克镇科技公司将荧在约克镇科技公司将荧光鱼引入市场后不久，光鱼引入市场后不久，荧光蛋白便迅速在商业荧光蛋白便迅速在商业上得到应用。在美国，上得到应用。在美国，读者可以在加利福尼亚读者可以在加利福尼亚以外的任何一个州购买以外的任何一个州购买到荧光鱼。到荧光鱼。(来源：新来源：新浪科技浪科技/孝文孝文)GFP在肿瘤发病机制研究中的应用在肿瘤发病机制研究中的应用v

47、GFP是一个分子量较小的蛋白是一个分子量较小的蛋白,易与其他一些目的基因形成融合易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响目的基因产物的空蛋白且不影响目的基因产物的空间构象和功能。间构象和功能。GFP与目的基与目的基因融合因融合,将目的基因标记为绿色将目的基因标记为绿色,即可定量分析目的基因的表达水即可定量分析目的基因的表达水平平,显示其在肿瘤细胞内的表达显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化位置和量的变化,为探讨该基因为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。分子机制提供便利条件。荧光绒毛荧光绒毛v2008年绿色荧光蛋白成为年绿色荧光蛋白成为诺贝

48、奖的大赢家。这张图片诺贝奖的大赢家。这张图片就是用诺贝尔奖技术炮制的就是用诺贝尔奖技术炮制的小肠绒毛图片，小肠绒毛是小肠绒毛图片，小肠绒毛是凸出于小肠的细小手状结构，凸出于小肠的细小手状结构，具有吸收食物营养的功能。具有吸收食物营养的功能。科学家将红色荧光蛋白标记科学家将红色荧光蛋白标记导入小肠绒毛细胞中，展现导入小肠绒毛细胞中，展现出带有荧光标记的小肠绒毛出带有荧光标记的小肠绒毛。真皮成纤维细胞真皮成纤维细胞v成纤维细胞成纤维细胞制造胶原蛋白，在制造胶原蛋白，在体内充当脚手架的作用，支持体内充当脚手架的作用，支持其它细胞呆在适当的位置，同其它细胞呆在适当的位置，同时让其它化学物质时让其它化学

49、物质“沐浴沐浴”这些这些细胞。细胞。v图像中的这些细胞来自图像中的这些细胞来自人体皮人体皮肤肤，被用于研究病毒是如何透，被用于研究病毒是如何透过皮肤入侵人体的。过皮肤入侵人体的。v为帮助了解这些病毒壳在做为帮助了解这些病毒壳在做什么，科学家让它和绿色荧光什么，科学家让它和绿色荧光蛋白结合，从而使它呈现为蛋白结合，从而使它呈现为绿绿色色。成纤维细胞的肌动蛋白被成纤维细胞的肌动蛋白被染为了染为了红色红色，DNA则为则为蓝色蓝色。应用举例二：应用举例二：应用举例二：应用举例二：有机磷水解酶（有机磷水解酶（Organophosphorus hydrolase,OPH）能够降解许多种有机磷农药。将）能够

50、降解许多种有机磷农药。将GFP基因与基因与OPH基因的基因的5端融合，构建端融合，构建GFP-OPH融合基因融合基因，并将，并将其在大肠杆菌中表达。经其在大肠杆菌中表达。经IPTG诱导后，绿色荧光直接诱导后，绿色荧光直接可见，融合蛋白同时保持了可见，融合蛋白同时保持了OPH 和和GFP的生物活性。的生物活性。此外，由于此外，由于GFP的荧光强度与的荧光强度与OPH活力成正比，还可活力成正比，还可通过荧光强度的检测对通过荧光强度的检测对OPH进行定量分析。进行定量分析。控制某一代谢途径的相关基因控制某一代谢途径的相关基因,紧密连锁地排列在一起紧密连锁地排列在一起.Lac operon I p o