基因工程复习（一）——重组DNA的模拟操作与拓展探究授课课.pptx

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1、专题一基因工程专题一基因工程(复习课第复习课第1 1课时课时)重组重组DNADNA分子的模拟操作与拓展探究分子的模拟操作与拓展探究贵州省实验中学生物组贵州省实验中学生物组 任任 和和人民教育出版社高中生物教材人民教育出版社高中生物教材.选修三现代选修三现代生物科技专题生物科技专题什么是基因工程？什么是基因工程？描述下列转基因植物操作的过程？描述下列转基因植物操作的过程？基因工程操作包括哪几个步骤？中最核心的步骤是基因工程操作包括哪几个步骤？中最核心的步骤是?表达载体表达载体=复制原点复制原点+启动子启动子+目的基因目的基因+终止子终止子+标记基因标记基因1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒

2、，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_ _处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶两个末端两个末端限制酶限制酶两个末端两个末端切口切口DNADNA连接酶连接酶目的基因与运载体结合，构建基因表达载目的基因与运载体结合，构建基因表达载体体切割磷酸切割磷酸二酯键二酯键分子手术刀：限制性核酸内切酶分子手术刀：限制性核酸内切酶一种限切酶一种限切酶只能识别只能识别一种一种特定

3、特定的核苷酸的核苷酸序列序列,并在并在特定特定切点切点切割切割DNADNA分子分子如如:EcoRI限制酶限制酶分子缝合针分子缝合针DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶：连接酶：可把可把DNADNA片段末端之间的缝隙片段末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，连接磷酸二酯键。起来，连接磷酸二酯键。E.coliDNA连接酶：连接酶：只连接黏性末端只连接黏性末端T4DNA连接酶：连接酶：既连接黏性末端，又连接平既连接黏性末端，又连接平末端，连接平末端的效率比较低末端，连接平末端的效率比较低甲甲乙乙GAATTCCGTAGAATTCGGATT 示例：受示例：受EcoRIEcoRI限制酶作用限制酶作用,并进

4、行连接并进行连接CTTCATGAATTCCCTAA GAAGTACTTAAGGGATT CTTAAGGCATCTTAAGCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAAAATTCCGTAG GGCATCTTAAAATTCCGTAG DNA1DNA1DNA2DNA2p 实验目的实验目的1 1、模拟不同来源、模拟不同来源DNADNA的准确切割和连接的准确切割和连接2 2、准确运用模拟的操作工具模拟将目的基因拼接到、准确运用模拟的操作工具模拟将目的基因拼接到质粒载体上质粒载体上3 3、说出只一种限制酶切割目的基因和质粒并构建表、说出只一种限

5、制酶切割目的基因和质粒并构建表达载体时可能发生的多种情况达载体时可能发生的多种情况4 4、模拟用两种不同的限制酶切割（双酶切）目的基、模拟用两种不同的限制酶切割（双酶切）目的基因、质粒并构建表达载体，说出可能发生的情况，因、质粒并构建表达载体，说出可能发生的情况，总结双酶切相对于一酶切的优势总结双酶切相对于一酶切的优势材料用具材料用具彩色打印（蓝色和粉红色）的彩色打印（蓝色和粉红色）的A4纸（纸（上上 有有基因基因和和质粒质粒DNA）小剪刀小剪刀:模拟模拟限制性内切酶限制性内切酶切割切割DNA胶布胶布:模拟模拟DNA连接酶连接连接酶连接DNA操作规则操作规则将模拟四个操作将模拟四个操作左手边第

6、一人为小组长左手边第一人为小组长小组内讨论、合作完成任务，要争取更多的人有小组内讨论、合作完成任务，要争取更多的人有操作的机会和交流机会操作的机会和交流机会操作一（类同课本实验）：模拟不同来源线性操作一（类同课本实验）：模拟不同来源线性DNA的切割和末端的连接的切割和末端的连接1、含目的基因的、含目的基因的DNA部分序列部分序列,内有两个内有两个EcoRI酶切位点酶切位点.GAATTCGCACGTCACTATGTAGGTCCGCCTAGAATTC.。.CTTAAGCGTGCAGTGATACATCCAGGCGGATCTTAAG.2、含一个、含一个EcoRI酶切位点的质粒部分序列酶切位点的质粒部分

7、序列 .ATCGTCACGTCAGGAATTCAACCTGTGACCGTG.。.TACGAGTGCAGTCCTTAAGTTGGACACTGGCAC.G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G剪刀剪刀胶布胶布操作过程操作过程1 1、从打印纸上找到含、从打印纸上找到含“目的基因目的基因”的的DNADNA和和“质质粒粒”，剪裁成等宽的序列，剪裁成等宽的序列2 2、在含目的基因的、在含目的基因的DNADNA两侧找到酶切位

8、点用剪刀两侧找到酶切位点用剪刀进行切割，并将切开后的末端进行连接进行切割，并将切开后的末端进行连接（强调：切割位点、连接位点）（强调：切割位点、连接位点）展示、解释、评价展示、解释、评价讨论：讨论：（1 1）、不同限制酶在质粒和目的基因上切割产生）、不同限制酶在质粒和目的基因上切割产生的末端是否相同？为什么？的末端是否相同？为什么？（2 2）、如果连接的时候碱基不能配对是什么有原）、如果连接的时候碱基不能配对是什么有原因造成的？因造成的？结果展示结果展示操作二：模拟将基因连接到质粒载体上操作二：模拟将基因连接到质粒载体上（末端分别（末端分别为平末端）为平末端）3、含目的基因的、含目的基因的DN

9、A部分序列部分序列,内有两个内有两个SmaI酶切位点酶切位点 .GGGCCCACGTCACTATGTAGGTCCGCCTAGGGCCC.。.CCCGGGTGCAGTGATACATCCAGGCGGATCCCGGG.4、含一个、含一个SmaI酶切位点的质粒部分序列酶切位点的质粒部分序列 .ATCGTCACGTCAGGGCCCAACCTGTGACCGTG.。.TACGAGTGCAGTCCCCGGTTGGACACTGGCAC.操作三：模拟将基因连接到质粒载体上操作三：模拟将基因连接到质粒载体上（末端为黏（末端为黏性末端）性末端）5、含目的基因的、含目的基因的DNA部分序列部分序列,内有两个内有两个Ec

10、oRI酶切位点酶切位点.GAATTCGCACGTCACTATGTAGGTCCGCCTAGAATTC.。.CTTAAGCGTGCAGTGATACATCCAGGCGGATCTTAAG.6、含一个、含一个EcoRI酶切位点的质粒部分序列酶切位点的质粒部分序列 .ATCGTCACGTCAGGAATTCAACCTGTGACCGTG.。.TACGAGTGCAGTCCTTAAGTTGGACACTGGCAC.操作过程操作过程1 1、从打印纸上找到含、从打印纸上找到含“目的基因目的基因”的的DNADNA和和“质质粒粒”，剪裁成等宽的序列，剪裁成等宽的序列2 2、将质粒首位用胶布连接、将质粒首位用胶布连接,形成真

11、正的环状质粒，形成真正的环状质粒，在质粒上找到酶切位点进行切割在质粒上找到酶切位点进行切割3 3、在含目的基因的、在含目的基因的DNADNA两侧找到酶切位点用剪刀两侧找到酶切位点用剪刀进行切正确割进行切正确割4 4、尝试用胶布将有末端的基因与质粒进行连接、尝试用胶布将有末端的基因与质粒进行连接5、连接出可表达的连接、连接出可表达的连接操作二：模拟将基因连接到质粒载体上操作二：模拟将基因连接到质粒载体上（末端为平末端）（末端为平末端）操作三：模拟将基因连接到质粒载体上操作三：模拟将基因连接到质粒载体上（末端为黏性末端）（末端为黏性末端）展示交流讨论展示交流讨论1 1、两种限制酶切割、两种限制酶切

12、割DNADNA产生的末段有什么不同？产生的末段有什么不同？说明了酶的什么特性？说明了酶的什么特性？2 2、操作二、三中用到的连接酶相当于哪种酶操作二、三中用到的连接酶相当于哪种酶?应应当连接什么部位？当连接什么部位？3 3、若将只用一种限制酶切割获取的大量目的基因、若将只用一种限制酶切割获取的大量目的基因和质粒放在一起连接会发生什么情况和质粒放在一起连接会发生什么情况?4 4、目的基因和质粒发生任意连接过程中，若考虑、目的基因和质粒发生任意连接过程中，若考虑两两连接有哪些情况？两两连接有哪些情况？5 5、目的基因倒置插入有什么后果？、目的基因倒置插入有什么后果？在基因工程操作中，若用同一种限制

13、酶分别切割目的基因在基因工程操作中，若用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用和质粒，再用DNADNA连接酶进行连接，形成能表达的重组质连接酶进行连接，形成能表达的重组质粒的效率粒的效率 不是不是 （是是/不是）不是）100%100%，原因可能，原因可能如下：如下：1 1、目的基因、质粒发生、目的基因、质粒发生 自身环化自身环化 连接；连接；2 2、目的基因倒置插入、目的基因倒置插入 质粒质粒 ；3 3、若考虑两两连接，会形成、若考虑两两连接，会形成 目的基因与目的基因目的基因与目的基因 、质粒与质粒质粒与质粒 、目的基因与质粒（正目的基因与质粒（正向插入和倒置插入）向插入和倒置插入）三种类

14、型两两连接的分子。三种类型两两连接的分子。4 4、其中我们想要的重组质粒是、其中我们想要的重组质粒是：目的基因正向插入的重目的基因正向插入的重组质粒组质粒如何解决一酶切的这些问题？提出可能的如何解决一酶切的这些问题？提出可能的方案？方案？结论结论:操作四：模拟双酶切和连接，并和一酶切比较操作四：模拟双酶切和连接，并和一酶切比较7、含目的基因的、含目的基因的DNA部分序列部分序列,内有一个内有一个EcoRI酶切位点和一个酶切位点和一个SmaI酶酶切位点切位点 .GGGCCCGCACGTCACTATGTAGGTCCGCCTAGAATTC.。.CCCGGGCGTGCAGTGATACATCCAGGCG

15、GATCTTAAG.8、内有一个、内有一个EcoRI酶切位点和一个酶切位点和一个SmaI酶切位点的质粒部分序列酶切位点的质粒部分序列 .TCAGGAATTCAACCTGTGACCGTGATGGGCCC.。.AGTCCTTAAGTTGGACACTGGCACTACCCGGG.操作过程操作过程1 1、从打印纸上找到含、从打印纸上找到含“目的基因目的基因”的的DNADNA和和“质质粒粒”，剪裁成等宽的序列，剪裁成等宽的序列2 2、将质粒首位用胶布连接、将质粒首位用胶布连接,形成真正的环状质粒，形成真正的环状质粒，在质粒上找到酶切位点进行切割在质粒上找到酶切位点进行切割3 3、在含目的基因的、在含目的基

16、因的DNADNA两侧找到酶切位点用剪刀两侧找到酶切位点用剪刀进行切正确割进行切正确割4 4、尝试用胶布将有末端的基因与质粒进行连接、尝试用胶布将有末端的基因与质粒进行连接思考：一酶切的问题在这时候还会不会出现？思考：一酶切的问题在这时候还会不会出现？5、连接出可表达的连接、连接出可表达的连接结论：结论：用两种产生不同末端的限制酶分别切割目的用两种产生不同末端的限制酶分别切割目的基因和载体基因和载体优点：可以有效防止优点：可以有效防止（1）、？）、？（2）、？）、？避免自身环化避免自身环化避免基因倒置插入质粒避免基因倒置插入质粒结论：结论：用两种产生不同末端的限制酶分别切割目的用两种产生不同末端

17、的限制酶分别切割目的基因和载体基因和载体优点：可以有效防止优点：可以有效防止（1）、目的基因和质粒自身环化）、目的基因和质粒自身环化（2）、目的基因的倒置插入）、目的基因的倒置插入注意：这时注意：这时,目的基因和目的基因、质粒和质粒、目的基因和目的基因、质粒和质粒、目的基因和质粒仍然可以发生相互两两连接，所目的基因和质粒仍然可以发生相互两两连接，所以要通过其他技术手段进行筛选操作。以要通过其他技术手段进行筛选操作。这样构建表达载体的效率大大提高。构建好这样构建表达载体的效率大大提高。构建好表达载体后，下一步就可以做基因工程的后续操表达载体后，下一步就可以做基因工程的后续操作了。作了。总结p基因

18、工程的操作流程基因工程的操作流程p基因工程操作的核心：构建表达载体基因工程操作的核心：构建表达载体p基因工程操作的三大工具基因工程操作的三大工具p一种限制酶切割基因和质粒的缺点一种限制酶切割基因和质粒的缺点p两种限制酶切割基因和质粒的优势两种限制酶切割基因和质粒的优势1、下面图中下面图中a a、b b、c c、d d代表的结构正确的是：代表的结构正确的是：（）A Aaa质粒质粒RNARNAB Bbb限制性外切酶限制性外切酶C C cRNAcRNA聚合酶聚合酶 D Ddd外源基因外源基因反馈练习2、列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图、列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图、图2中箭

19、头表示相关中箭头表示相关限制酶的酶切位点。限制酶的酶切位点。(1)用图中的质粒和外源用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因切割，原因是是_目的基因被切断，无法保证完整性目的基因被切断，无法保证完整性_。(2)与只使用与只使用EcoR相比较，使用相比较，使用BamH和和Hind两种限制酶同时处理两种限制酶同时处理质粒、外源质粒、外源DNA的优点在于可以防止的优点在于可以防止_目的基因、质粒自身环化，目的目的基因、质粒自身环化，目的基因倒置插入质粒基因倒置插入质粒_。3、转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有、转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒

20、上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答：等四种限制酶切割位点。请回答：（1）构建含抗病基因的表达载体）构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶时，应选用限制酶 ，对对 进行切割进行切割。4、科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的质粒进行重、科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的质粒进行重组，将重组质粒导入大肠杆菌，人生长激素基因成功地在组，将重组质粒导入大肠杆菌，人生长激素基因成功地在大肠杆菌中得以表达。但在进行基因工程的操作过程中，大肠杆菌中得以表达。但在进行基因工程的操作过程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，

21、便于重组和筛选。质粒载体上至少必须保留一个标记基因，便于检测目选。质粒载体上至少必须保留一个标记基因，便于检测目的基因是否导入受体细胞。的基因是否导入受体细胞。已知限制酶已知限制酶I的识别序列和切点的识别序列和切点是是GGATCC，限制酶，限制酶II的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATC，据图回答：据图回答：（1）根据图示分析，目的基因导入到了质粒中的四环素）根据图示分析，目的基因导入到了质粒中的四环素抗性基因内部，这说明在构建重组质粒过程中，是用了限抗性基因内部，这说明在构建重组质粒过程中，是用了限制酶制酶_II_来切割目的基因，用了限制酶来切割目的基因，用了限制酶_I_来切割质粒，用

22、来切割质粒，用_酶实现目的基因和质粒的连酶实现目的基因和质粒的连接恢复接恢复_ 键。在连接过程中目的基因和质粒上的黏键。在连接过程中目的基因和质粒上的黏性末端之间遵循性末端之间遵循 原则。原则。(2)画出含目的基因的画出含目的基因的DNA被切割后产生的片段，标注出被切割后产生的片段，标注出黏性末端。黏性末端。（3）这里的目的基因导入质粒形成能表达的重组质粒的这里的目的基因导入质粒形成能表达的重组质粒的效率是不是效率是不是100%？为什么？为什么？(可能发生目的基因的倒置插可能发生目的基因的倒置插入入)2、列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图、列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图、

23、图2中箭头表示相关中箭头表示相关限制酶的酶切位点。限制酶的酶切位点。(1)用图中的质粒和外源用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因切割，原因是是_目的基因被切断，无法保证完整性目的基因被切断，无法保证完整性_。(2)与只使用与只使用EcoR相比较，使用相比较，使用BamH和和Hind两种限制酶同时处理两种限制酶同时处理质粒、外源质粒、外源DNA的优点在于可以防止的优点在于可以防止_目的基因、质粒目的基因、质粒自身环化，目的自身环化，目的基因两两连接、质粒两两连接、目的基因倒置插入基因两两连接、质粒两两连接、目的基因倒置插入_。3、转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有、转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有Pst、Sma、EcoR、Apa等四种限制酶切割位点。请回答：等四种限制酶切割位点。请回答：（1）构建含抗病基因的表达载体）构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶时，应选用限制酶 ，对对 进行切割进行切割。谢谢大家!精致儒雅的省实中校园