土壤中分解尿素细菌的分离与计数.ppt

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1、课题课题2 2土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数课题背景课题背景1.1.尿素的利用尿素的利用 尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作物被农作物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之之后才能被植物利用。后才能被植物利用。2.2.细菌利用尿素的原因细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶+CO+CO2 2NHNH3 3+H+H2 2O O3.3.课题目的课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离

2、出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样统计每克土壤样品中究竟含有多少这样 的细菌的细菌一一.基础知识基础知识筛选菌株筛选菌株统计菌落数目统计菌落数目设置对照设置对照1.1.实例：实例：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。原因：因为热泉温度原因：因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多淘汰了绝大多 数微生物只有数微生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是一种在体外将一种在体外将少量少量DNADNA大量复制大量复

3、制的技术，此项的技术，此项技术要求使用技术要求使用耐高温耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。筛选菌株筛选菌株一一.基础知识基础知识结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过培养一定时间后，该菌数量上升，再通过 平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2.2.实验室筛选菌株实验室筛选菌株 选择性培养基选择性培养基原理：原理：要分离一种微生物，必须根据该微生物的要分离一种微生物，必须根据该微

4、生物的要分离一种微生物，必须根据该微生物的要分离一种微生物，必须根据该微生物的 特点，包括营养、生理、生长条件等进行特点，包括营养、生理、生长条件等进行特点，包括营养、生理、生长条件等进行特点，包括营养、生理、生长条件等进行 设计；设计；设计；设计；人为提供有利于人为提供有利于人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株目的菌株目的菌株生长的条生长的条生长的条生长的条 件件件件(包括营养、温度、包括营养、温度、包括营养、温度、包括营养、温度、pHpHpHpH等等等等)，促进目的菌，促进目的菌，促进目的菌，促进目的菌 株生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。株生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。株

5、生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。株生长，同时抑制或阻止其他微生物生长。选择培养基：选择培养基：允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制抑制 或阻止其他种类或阻止其他种类微生物生长的培养基微生物生长的培养基3.3.实验原理实验原理（1 1）分离尿素细菌：）分离尿素细菌：）分离尿素细菌：）分离尿素细菌：以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源的选择性培养基的选择性培养基原理原理原理原理：培养基的：培养基的：培养基的：培养基的氮源为尿素氮源为尿素氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶脲酶脲酶的微生物的微生物的微生物的微生物 才能分解尿素，以尿

6、素作为氮源。才能分解尿素，以尿素作为氮源。才能分解尿素，以尿素作为氮源。才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏缺乏缺乏脲酶的微脲酶的微脲酶的微脲酶的微 生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发 育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选 择出分解尿素的微生物。择出分解尿素的微生物。择出分解尿素的微生物。择出分解尿素的微生物。15.0g15.0g

7、琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO447H7H2 2OO2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 4土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：

8、碳源：碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：氮源：氮源：尿素尿素尿素尿素（2 2）鉴定尿素细菌：）鉴定尿素细菌：）鉴定尿素细菌：）鉴定尿素细菌：尿素尿素尿素尿素脲酶脲酶脲酶脲酶氨氨氨氨PHPH酚红指示剂酚红指示剂酚红指示剂酚红指示剂红色红色红色红色PHPH酚红指示剂酚红指示剂酚红指示剂酚红指示剂黄色黄色黄色黄色（二）统计菌落数目（二）统计菌落数目1.1.显微镜直接计数显微镜直接计数方法：方法：利用血球计数板利用血球计数板(血细胞计数板血细胞计数板）缺点：缺点：缺点：缺点：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；

9、需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；2.2.间接计数（活菌计数法）间接计数（活菌计数法）原理：原理：原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上 所形成的所形成的所形成的所形成的一个菌落一个菌落一个菌落一个菌落是由是由是由是由一个单细胞一个单细胞一个单细胞一个单细胞繁殖而成繁殖而成繁殖而成繁殖而成 的，即的，即的，即的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。一个菌落代表原先的一个单细胞。一个菌落代表原先的一个单

10、细胞。一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：常用方法：常用方法：常用方法：稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。稀释涂布平板法。公式：公式：公式：公式：每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(C(C(C(CV)V)V)V)M M M M C C C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌代表某一稀释度下平板上生长的平均菌代表某一稀释度下平板上生长的平均菌代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，落数，落数，落数，V V V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积

11、(ml)(ml)(ml)(ml)，M M M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。代表稀释倍数。代表稀释倍数。计算公式：计算公式：每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=（CV）M某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4 B关键：关键：稀释度稀释度不同微生物在土壤中含量不同，不同微生物在土壤中含量不同，不同微生物在土壤中含量不同，不同微生物在土壤中含量不同，分分分分离不同的微生物采离不同的微生物采离不同的微生物采离不同的微生物采用不同的稀用不同的

12、稀用不同的稀用不同的稀释度释度释度释度稀释倍数稀释倍数目的目的细菌细菌10104 4、10105 5、10106 6保证获得菌落数在保证获得菌落数在保证获得菌落数在保证获得菌落数在30303030300300300300之间、适于计之间、适于计之间、适于计之间、适于计数的平板数的平板数的平板数的平板放线菌放线菌10103 3、10104 4、10105 5真菌真菌10102 2、10103 3、10104 4缺点：缺点：若稀释度不够，则菌落数少于菌株数若稀释度不够，则菌落数少于菌株数原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察原因是当两个或多个细胞连

13、在一起时，平板上观察原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落到的只是一个菌落到的只是一个菌落到的只是一个菌落3.3.滤膜法：滤膜法：用于检测饮用水中大肠杆菌的含量用于检测饮用水中大肠杆菌的含量用于检测饮用水中大肠杆菌的含量用于检测饮用水中大肠杆菌的含量注意事项注意事项重复实验：重复实验：重复实验：重复实验：为为为为使结果接近真实值可将同一稀释使结果接近真实值可将同一稀释使结果接近真实值可将同一稀释使结果接近真实值可将同一稀释度加度加度加度加 到到到到三个或三个以上三个或三个以上三个或三个以上三个或三个以上的平皿中，经涂的平皿中，经涂的平皿中，经涂的平皿中，经涂布，布，布，布

14、，培培培培养计算出菌落养计算出菌落养计算出菌落养计算出菌落平均平均平均平均数数数数。确定标准值：确定标准值：确定标准值：确定标准值：为了保证结果准确，一般选择菌落数为了保证结果准确，一般选择菌落数为了保证结果准确，一般选择菌落数为了保证结果准确，一般选择菌落数 在在在在30303030300300300300的平板上进行计数。偏高偏的平板上进行计数。偏高偏的平板上进行计数。偏高偏的平板上进行计数。偏高偏 低均要舍弃低均要舍弃低均要舍弃低均要舍弃统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的统计的菌落往往比活菌的实际数目实际数目实际数目实际数目低低低低。实例：在做分解尿素的细

15、菌的筛选与统计菌实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌 落数目的实验时，落数目的实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6 倍稀释的培养基中筛选出大约倍稀释的培养基中筛选出大约150150个菌个菌 落，但是其他同学在同样的稀释度下落，但是其他同学在同样的稀释度下 只选择出大约只选择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原因：原因：土样不同，土样不同，培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误 (或者是混入了其他的含氮物质或者是混入了其他的含氮物质)小结：小结：通过这个事例可以看出，实验结果通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。要有说服力，对照

16、的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A A同学配制的培养基在不加土样的情同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。否受到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A A同学一致，则证明同学一致，则证明A A无误；无误；如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养基的配制有问题。基的配制有问题。（三）设置对照（三）设置对照对照对照1 1目的目的目的目的：排除实验组中非测

17、试因素对实验结果的影响，提：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提 高实验结果的可信度高实验结果的可信度高实验结果的可信度高实验结果的可信度对照组：未接种的培养基对照组：未接种的培养基对照组：未接种的培养基对照组：未接种的培养基实验组：接种的培养基实验组：接种的培养基实验组：接种的培养基实验组：接种的培养基确认培养基是否有杂菌污染确认培养基是否有杂菌污染确认培养基是否有杂菌污染确认培养基是否有杂菌污染对照对照2 2对照组：牛肉膏蛋白胨培养基对照组：牛肉膏蛋白胨培养基对照组：牛肉膏蛋白胨培养基对照组：牛肉

18、膏蛋白胨培养基实验组：选择性培养基实验组：选择性培养基实验组：选择性培养基实验组：选择性培养基证明培养基有选择作用证明培养基有选择作用证明培养基有选择作用证明培养基有选择作用二二.实验设计实验设计1.1.设计内容设计内容实验方案、用具材料、实验步骤、时间安排等实验方案、用具材料、实验步骤、时间安排等实验方案、用具材料、实验步骤、时间安排等实验方案、用具材料、实验步骤、时间安排等2.2.实验步骤实验步骤配置培养基配置培养基配置培养基配置培养基选择培养基选择培养基选择培养基选择培养基以尿素为唯一氮源以尿素为唯一氮源牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基作为对照作为

19、对照制备土壤制备土壤制备土壤制备土壤稀释液稀释液稀释液稀释液土壤取样土壤取样土壤取样土壤取样取样工具需灭菌取样工具需灭菌稀释土样稀释土样稀释土样稀释土样方法：方法：方法：方法：样品样品无菌生理盐水无菌生理盐水摇匀、振荡摇匀、振荡梯度稀释梯度稀释梯度稀释梯度稀释注意：不同微生物的稀释度是不一样的注意：不同微生物的稀释度是不一样的注意：不同微生物的稀释度是不一样的注意：不同微生物的稀释度是不一样的注意：应在火焰旁称取土壤注意：应在火焰旁称取土壤注意：应在火焰旁称取土壤注意：应在火焰旁称取土壤10g10g10g10g 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在

20、火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行涂布涂布涂布涂布注意：每个稀释度涂布注意：每个稀释度涂布注意：每个稀释度涂布注意：每个稀释度涂布3 3 3 35 5 5 5个平板个平板个平板个平板 平行重复，减少误差平行重复，减少误差平行重复，减少误差平行重复，减少误差 设置对照实验设置对照实验设置对照实验设置对照实验 培养皿标记：日期、菌种、稀释度等培养皿标记：日期、菌种、稀释度等培养皿标记：日期、菌种、稀释度等培养皿标记：日期、菌种、稀释度等培养观察培养观察培养观察培养观察温度和时间不同温度和时间不同温度和时间不同温度和时间不同细菌：细

21、菌：细菌：细菌：3030303037373737培养培养培养培养1 1 1 12d2d2d2d放线菌：放线菌：放线菌：放线菌：2525252528282828培养培养培养培养5 5 5 57d7d7d7d霉菌：霉菌：霉菌：霉菌：2525252528282828培养培养培养培养3 3 3 34d4d4d4d观察：在观察：在观察：在观察：在菌落计数时，每隔菌落计数时，每隔菌落计数时，每隔菌落计数时，每隔24h24h24h24h统计统计统计统计一次菌落数一次菌落数一次菌落数一次菌落数 目。目。目。目。选选选选取菌落数目稳定取菌落数目稳定取菌落数目稳定取菌落数目稳定时的记时的记时的记时的记录作录作录作

22、录作为结为结为结为结 果果果果，以防止因培养以防止因培养以防止因培养以防止因培养时间不时间不时间不时间不足而导致遗足而导致遗足而导致遗足而导致遗漏菌漏菌漏菌漏菌 落落落落的数目。的数目。的数目。的数目。微生物的培养与观察微生物的培养与观察培养观察培养观察培养观察培养观察温度和时间不同温度和时间不同温度和时间不同温度和时间不同细菌：细菌：细菌：细菌：3030303037373737培养培养培养培养1 1 1 12d2d2d2d放线菌：放线菌：放线菌：放线菌：2525252528282828培养培养培养培养5 5 5 57d7d7d7d霉菌：霉菌：霉菌：霉菌：2525252528282828培养培

23、养培养培养3 3 3 34d4d4d4d观察：在观察：在观察：在观察：在菌落计数时，每隔菌落计数时，每隔菌落计数时，每隔菌落计数时，每隔24h24h24h24h统计统计统计统计一次菌落数一次菌落数一次菌落数一次菌落数 目。目。目。目。选选选选取菌落数目稳定取菌落数目稳定取菌落数目稳定取菌落数目稳定时的记时的记时的记时的记录作录作录作录作为结为结为结为结 果果果果，以防止因培养以防止因培养以防止因培养以防止因培养时间不时间不时间不时间不足而导致遗足而导致遗足而导致遗足而导致遗漏菌漏菌漏菌漏菌 落落落落的数目。的数目。的数目。的数目。计数和计算计数和计算计数和计算计数和计算鉴定脲酶鉴定脲酶鉴定脲酶

24、鉴定脲酶尿素尿素+脲酶脲酶+酚红指示剂酚红指示剂酚红指示剂酚红指示剂尿素尿素+水水+酚红指示剂酚红指示剂酚红指示剂酚红指示剂2525242448h48h48h48h红色红色红色红色黄色黄色黄色黄色1.1.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()()A.COA.CO2 2和和N N2 2 B.B.

25、葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练C CD D3.3.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚聚 合酶。合酶。B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值。作为该样品菌落数的估计值。C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测

26、试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。种类最多。4.4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C 5、实验测定链霉素对、实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用种细菌的抗生素效应，用3种细种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37条条件下恒温培养件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是下叙述，不正确的是 A链霉素能阻止结核菌的生长链霉素能阻止结核菌的生长 B链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效C链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效 D链霉素可以用于治疗伤寒病人链霉素可以用于治疗伤寒病人D D