乙肝两对半定性测定.pptx

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1、乙肝两对半测定 酶联免疫法实习生：廖於波指导老师：李海龙第一页，共三十二页。HBV是乙型病毒性肝炎的病原体。HBV感染呈世界性流行，但不同地区感染的流行程度差异很大。据WHO报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。我国属高流行地区一般地区HBsAg阳性率为7.18%。第二页，共三十二页。乙肝病毒血清标志物HBsAgn第一个出现，感染后1-2周即可阳性n阳性表示存在HBV感染HBsAbn出现在HBsAg消失后n保护性抗体n疫苗免疫成功的标志 第三页，共三十二页。乙肝病毒血清标志物HBeAgn病毒复制标志

2、n传染性强HBeAb n传染性降低n长期存在是DNA与肝细胞整合的结果第四页，共三十二页。乙肝病毒血清标志物HBcAg nHBV复制的标志n血清中难以检测出来IgM-HBcAb n急性HBV感染IgG-HBcAbn急性感染恢复期和慢性持续感染第五页，共三十二页。检测HBV病毒血清标志物是临床最常用的病原学诊断方法。HBV具有三个抗原抗体系统，即乙肝外表抗原HBSAg和乙肝外表抗体HBsAb、e抗原HBeAg和e抗体HBeAb、核心抗原HBcAg核心抗体HBcAb，由于HBcAg在血液中难于检出，故临床免疫学检测不包括HBcAg，目前常采用酶联免疫法和化学发光法检测。第六页，共三十二页。酶联免疫

3、吸附实验原理用于检测包被于固相板孔中的待测抗原或抗体。即用酶标记抗体，并将能看出的抗原或抗体吸附在固相载体外表，使抗原抗体反响在固相载体外表进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。颜色反响的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。第七页，共三十二页。乙肝病毒血清标志物检测原理血清学标志原理包被试剂标记或结合物结果判断HBsAg夹心法HBsAbHBsAb显色(+)HBsAb夹心法HBsAgHBsAg显色(+)HBeAg夹心法HBeAbHBeAb显色(+)HBeAb竞争法HBeAbHBeAb及中和抗原不显色(+)HBcAb竞争法HBcAgHBcAb不显色(+)第八

4、页，共三十二页。标本本要求采集：血浆：使用抗凝血浆管枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一为抗凝剂采集样品。样品离心别离后，提取血浆用于检测。血清：采用正确医用技术采集标本。离心别离后，提取血清样品用于检测。第九页，共三十二页。标本要求储存：样品可存放于28冰箱，24小时内测定。假设需长时间保存，那么应冻存于-20以下，防止反复冻融。上述样品使用前应恢复到室温，轻轻摇动混匀。假设标本有沉淀物形成，应离心除去，并确定未变质方可使用。严重融血或脂血标本不可使用。第十页，共三十二页。试剂安图生物编号编号组分名称组分名称96人份人份1包被板69孔X1块2样品稀释液2.3ml X1瓶3酶结合物5.5ml X1瓶

5、4底物液6.2ml X1瓶5显色剂6.2ml X1瓶6洗涤液30ml X1瓶7终止液5.5ml X1瓶8阴性对照1.0ml X1瓶9阳性对照1.0ml X1瓶10子母袋1个11说明书1份12板贴3张主要组成成分主要组成成分第十一页，共三十二页。实验前准备1.取出试剂盒及待测样品，将所有试剂及样品恢复至室温1825。2.将恒温箱或水浴锅调至反响温度。3.洗液用蒸馏水作20倍稀释后备用。第十二页，共三十二页。检验步骤排板第十三页，共三十二页。检验步骤外表抗原两步法1.留一孔作空白对照，参加样本稀释液20ul/孔含空白孔，其他参加阴性对照三孔和阳性对照二孔100ul/孔及待测标本100ul/孔于相应

6、的反响孔内。2.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀该步骤非常重要。3.贴上板贴，置37下温育60分钟。第十四页，共三十二页。检验步骤4.撕下板贴，除空白孔外，各孔参加酶结合物50ul。5.在微型振荡器上振荡30秒使孔内液体混合均匀该步骤非常重要。6.贴上板贴，置37下温育30分钟。7.撕下板贴，洗板6次，最后在吸水纸上拍干。8.每孔参加底物液、显色剂各50ul，37避光温育30分钟。第十五页，共三十二页。检验步骤9.加终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀后，立即测试结果。10.使用酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。第十六页，共三十二页。检验步骤外表抗体、e抗原、e抗体、核心抗体一步法

7、1.留一孔空白，三孔参加阴性对照、二孔参加阳性对照各50ul/孔，其他各孔分别参加样本50ul(HBcAb测定时待测血清用生理盐水1:30稀释50ul血清+1.5ml生理盐水)。2.除空白孔外，各孔参加酶结合物50ul。3.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀该步骤非常重要。4.贴上板贴，置37下温育30分钟。第十七页，共三十二页。检验步骤5.撕下板贴，洗板6次，最后在吸水纸上拍干。6.每孔参加底物液、显色剂各50ul，37避光反响10分钟。7.加终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀后，立即测试结果。8.使用酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。第十八页，共三十二页。第十九页，共三十二页。

8、第二十页，共三十二页。第二十一页，共三十二页。结果判定血清学标志原理包被试剂标记或结合物结果判断HBsAg夹心法HBsAbHBsAb显色(+)HBsAb夹心法HBsAgHBsAg显色(+)HBeAg夹心法HBeAbHBeAb显色(+)HBeAb竞争法HBeAbHBeAb及中和抗原不显色(+)HBcAb竞争法HBcAgHBcAb不显色(+)1.肉眼判定第二十二页，共三十二页。结果判定2.酶标仪判定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值，根据OD值判定结果第二十三页，共三十二页。本卷须知浓缩洗涤液配制前充分摇匀。加样本时要加到孔底。加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体

9、混匀。如果滴加，滴加前应弃去1-2滴。第二十四页，共三十二页。本卷须知滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。勿将试剂滴在孔壁上。洗涤时各孔须加满，防止孔口内有游离酶残留。洗涤时注意孔与孔之间的交叉污染。脂血，溶血可影响结果。第二十五页，共三十二页。本卷须知所有样本都应按传染源处理。样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在。不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。第二十六页，共三十二页。影响检测结果的因素1.样本采集与处理的影响 1.1 标本严重溶血。1.2 标本凝固不全：血液还未开始凝固时即强行离心别离血清，使血清中仍残留局部

10、纤维蛋原。2、试剂的影响 2.1 不同批号。2.2 不同厂家。第二十七页，共三十二页。影响检测结果的因素3.操作技术的影响 3.1 加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。3.2 温浴影响。3.3 手洗条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果。第二十八页，共三十二页。常见模式及临床意义HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb临 床 意 义+急性或慢性乙型肝炎感染；提示HBV复制，传染性强大三阳大三阳+急性HBV感染趋向恢复；慢性HBsAg携带者；传染性弱小三阳小三阳+急性HBV感染；慢性HBsAg携带者；传染性弱+慢性HBsAg携带者易转阴

11、；急性HBV感染趋向恢复+急性HBV感染早期或慢性携带者，传染性强+急性HBV感染早期；急性HBV感染潜伏期；慢性HBV携带者，传染性弱第二十九页，共三十二页。常见模式及临床意义HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb临 床 意 义+非典型性或亚临床型HBV感染+注射过乙肝疫苗有免疫力；既往感染；假阳性+急性HBV感染后康复+HBV感染后已恢复+既往感染，仍有免疫力；HBV感染恢复期+既往感染未能测出HBsAb；恢复期HBsAg已消，HBsAb尚未出现；无症状HBsAg携带者过去和现在未感染过HBV第三十页，共三十二页。第三十一页，共三十二页。内容总结乙肝两对半测定 酶联免疫法。HBV感染呈世界性流行，但不同地区感染的流行程度差异很大。我国属高流行地区一般地区HBsAg阳性率为7.18%。急性感染恢复期和慢性持续感染。颜色反响的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。血浆：使用抗凝血浆管枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一为抗凝剂采集样品。假设标本有沉淀物形成，应离心除去，并确定未变质方可使用。3.洗液用蒸馏水作20倍稀释后备用第三十二页，共三十二页。