蛋白质的四级结构.ppt

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1、四四 蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构 (quaternary structure)(quaternary structure)是指亚基间的空间排布、亚基间相是指亚基间的空间排布、亚基间相互作用与接触部位的布局，不包括亚基互作用与接触部位的布局，不包括亚基本身的空间结构。本身的空间结构。亚基间以次级键相连，亚基间以次级键相连，绝无共价键绝无共价键1.1.概念概念蛋白质分子由两条或两条以上肽链组蛋白质分子由两条或两条以上肽链组成，每条肽链各自形成了独立的三级成，每条肽链各自形成了独立的三级结构结构，分子中的每一个具有独立三级分子中的每一个具有独立三级结构肽链结构肽链,称为亚基称为亚基 亚基亚基(

2、subunit)(subunit)2.2.维持蛋白质四级结构的作用力维持蛋白质四级结构的作用力主要是疏水作用主要是疏水作用次级键次级键盐键、氢键盐键、氢键 第三节第三节 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系（一）（一）一级结构是空间构象的基础一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系 以以124124个氨基酸残基组成的牛胰核个氨基酸残基组成的牛胰核糖核酸酶（糖核酸酶（4 4对二硫键）为例说明对二硫键）为例说明牛胰核糖核酸酶的变性与复性牛胰核糖核酸酶的变性与复性-巯基乙醇巯基乙醇尿素或盐酸胍尿素或盐酸胍透析透析有活性有活性无活性无活性1.1.一级

3、结构相似的蛋白质功能相似一级结构相似的蛋白质功能相似一级结构不同的蛋白质功能不同一级结构不同的蛋白质功能不同胰岛素的一级结构及种属差异胰岛素的一级结构及种属差异（二）一级结构与功能的关系（二）一级结构与功能的关系ACTH ACTH 促肾上腺素皮质激素促肾上腺素皮质激素MSHMSH 促黑激素促黑激素一级结构不同的蛋白质功能不同一级结构不同的蛋白质功能不同HbSHbS与与HbAHbA的区别的区别-亚基第亚基第6 6位氨基酸位氨基酸正常人：正常人：GluGlu患者：患者：ValVal由由4 4个亚基组成个亚基组成血红蛋白血红蛋白功能功能:运输运输O O2 2 二、蛋白质空间结构与功能的关系二、蛋白质

4、空间结构与功能的关系（一）肌红蛋白（一）肌红蛋白MbMb与血红蛋白与血红蛋白HbHb蛋白质的空间结构决定生物学功能蛋白质的空间结构决定生物学功能肌红蛋白（肌红蛋白（1 1个亚基）与血红蛋白（个亚基）与血红蛋白（4 4个亚基）个亚基）且一级结构有较大差异，但均具有与氧可逆地且一级结构有较大差异，但均具有与氧可逆地结合的能力结合的能力其结构特点是，都与血红素（辅基）共价结合其结构特点是，都与血红素（辅基）共价结合O2O2（二）血红蛋白构象变化与结合氧的能力（二）血红蛋白构象变化与结合氧的能力变构效应变构效应蛋白质分子与它的配体结合后构象发生变化蛋白质分子与它的配体结合后构象发生变化,其功能也随之变

5、化的现象其功能也随之变化的现象,称为称为变构效应变构效应协同效应协同效应蛋白质分子中的蛋白质分子中的1 1个亚基与其的配体结合后个亚基与其的配体结合后,能影响其它亚基与配体的结合能影响其它亚基与配体的结合,称为称为协同效应协同效应促进促进正协同效应正协同效应抑制抑制负协同效应负协同效应血红蛋白与氧结合的正协同效应血红蛋白与氧结合的正协同效应氧氧饱饱和和度度静脉血静脉血动脉血动脉血氧分压氧分压P P5050100%-HbMbMb第四节第四节 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质一一 、蛋白质的理化性质、蛋白质的理化性质（一）两性解离和等电点（一）两性解离和等电点蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况

6、蛋白质是两性电解质。在溶液中的带电状况主要取决于溶液的主要取决于溶液的pHpH值值PrPrCOOHCOOHNHNH3 3+PrPrCOOCOO-NHNH3 3+PrPrCOOCOO-NHNH2 2+OH+OH-+H+H+OH+OH-+H+H+pH=pH=pIpIpHpHpHpIpI此时溶液的此时溶液的pHpH值称为蛋白质的等电点值称为蛋白质的等电点(pIpI)等电点（等电点（pIpI）：）：在某一在某一pHpH值溶液中，值溶液中，蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当蛋白质酸性基团和碱性基团的解离程度相当蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零蛋白质分子所带正负电荷相等，净电荷为零蛋白质分子颗粒

7、大小蛋白质分子颗粒大小1-100nm1-100nm之间之间,属胶体颗粒范围，属胶体颗粒范围，在溶液中能形成稳定的胶体在溶液中能形成稳定的胶体蛋白质的胶体原因：蛋白质的胶体原因：表面形成水化层表面形成水化层表面同种电荷的斥力表面同种电荷的斥力（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质蛋白质的聚沉蛋白质的聚沉（三）蛋白质的变性、沉淀与凝固（三）蛋白质的变性、沉淀与凝固 变性后的蛋白称为变性蛋白质变性后的蛋白称为变性蛋白质1.1.蛋白质的变性作用蛋白质的变性作用 在某些理化因素作用下在某些理化因素作用下.蛋白质的构象被破坏，蛋白质的构象被破坏，失去其原有的性质和生物活性，称为蛋白质的失去其原有的性

8、质和生物活性，称为蛋白质的变性变性作用作用(denaturationdenaturation)概念概念:常见的变性因素：常见的变性因素：强酸、强酸、强碱、强碱、有机溶剂、有机溶剂、尿素、尿素、胍、胍、重金属重金属生物碱、生物碱、化学因素化学因素物理因素物理因素剧烈振荡剧烈振荡热、热、紫外线、紫外线、超声波、超声波、变性蛋白质的主要特征变性蛋白质的主要特征:（2 2）生物活性丧失生物活性丧失（4 4）变性蛋白质容易消化变性蛋白质容易消化（1 1）蛋白质分子中的次级键断裂）蛋白质分子中的次级键断裂,构象破坏，但构象破坏，但不涉及共价键的破坏不涉及共价键的破坏,一级结构不变一级结构不变（3 3）变性

9、蛋白质的溶解度常降低、粘度增加、变性蛋白质的溶解度常降低、粘度增加、扩散系数减小扩散系数减小除去变性因素后，有的变性蛋白质又可除去变性因素后，有的变性蛋白质又可恢复其天然构象和生物活性，这一现象恢复其天然构象和生物活性，这一现象称为蛋白质的复性称为蛋白质的复性蛋白质的复性蛋白质的复性(renaturationrenaturation)当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为出，这种现象称为蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀。蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀(pre-(pre-cipitatio

10、ncipitation)概念概念:应用应用:(1)(1)蛋白质分离纯化蛋白质分离纯化(2)(2)解毒解毒(3)(3)临床检验临床检验(1)(1)盐析法盐析法(salting outsalting out)向蛋白质溶液中加入大量中性盐使向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析蛋白质沉淀称为盐析常用的中性盐：常用的中性盐：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性变性硫酸铵、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钠、氯化钠等氯化钠等使蛋白质沉淀的方法使蛋白质沉淀的方法概念：概念：特点：特点：作用原理作用原理:盐离子与水亲和力极强，盐离子与水亲和力极强，夺去蛋白质的夺去蛋白质的水化层

11、水化层，减少分子间，减少分子间静电斥力静电斥力(2)(2)有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法使蛋白质脱去水化层使蛋白质脱去水化层,又能降低溶又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减液的介电常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀少，导致蛋白质分子聚集而沉淀 必须在低温下操作必须在低温下操作注意事项注意事项:尽量缩短处理的时间尽量缩短处理的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去甲醇甲醇、乙醇乙醇、丙酮丙酮缺点：缺点：原理原理:常用有机溶剂常用有机溶剂:常会使蛋白质变性常会使蛋白质变性重金属离子如重金属离子如CuCu2+2+、HgHg2+2+、AgAg2+2+、

12、PbPb2+2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀重金属蛋白盐而沉淀(3)(3)重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法此法常使蛋白质变性失活此法常使蛋白质变性失活若溶液若溶液pHpH大于蛋白质的大于蛋白质的pIpI，沉淀更易发生，沉淀更易发生缺点：缺点：原理原理:生生物物碱碱试试剂剂(如如鞣鞣酸酸、苦苦味味酸酸、钨钨酸酸等等)，某某些些酸酸类类(主主要要是是指指三三氯氯醋醋酸酸、磺磺酰酰水水杨杨酸酸和和硝硝酸酸等等)，与与带带正正电电的的蛋蛋白白质质 结结合合生成不溶性的盐而沉淀生成不溶性的盐而沉淀(

13、4)(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法反应溶液的反应溶液的pHpHpIpI，确保蛋白，确保蛋白质以阳离子形式存在质以阳离子形式存在 缺点：缺点：原理原理:常引起蛋白质变性常引起蛋白质变性注意事项注意事项:3.3.蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变蛋白质的凝固作用实际上是蛋白质变性后进一步发展的不可逆结果性后进一步发展的不可逆结果如加热可使蛋白质变为不容再溶如加热可使蛋白质变为不容再溶解的凝块解的凝块二、二、蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化(一一)盐析和有机溶剂沉淀盐析和有机溶剂沉淀(二二)电泳电泳(三三)透析和超滤透析和超滤(四四)层析层析

14、(五五)超速离心超速离心分类：分类：根据支持物的不同，电泳电泳可分为：根据支持物的不同，电泳电泳可分为：薄膜电泳、凝胶电泳薄膜电泳、凝胶电泳（二）电（二）电 泳泳概念：概念：带电颗粒在电场中向着所带电荷相反带电颗粒在电场中向着所带电荷相反 方向移动称为电泳。方向移动称为电泳。原理原理:不同的蛋白质的因结构、形状和带电不同的蛋白质的因结构、形状和带电 量的不同而有不同的泳动速度，从而量的不同而有不同的泳动速度，从而 达到分析和分离蛋白质的目的达到分析和分离蛋白质的目的 应用：应用：电泳技术是生化常用分析技术之一电泳技术是生化常用分析技术之一利用压力或离心力强行使水和小分子杂质利用压力或离心力强行

15、使水和小分子杂质通过超滤膜通过超滤膜(一种半透膜一种半透膜)除去，而蛋白质除去，而蛋白质留在膜上，称为留在膜上，称为超过滤超过滤将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于将蛋白质溶液放在半透膜的袋内，置于流动的适当的缓冲液（如纯水）中，小流动的适当的缓冲液（如纯水）中，小分子杂质（如硫酸铵、氧化钠等）从袋分子杂质（如硫酸铵、氧化钠等）从袋中透出，而蛋白质保留于袋中从而将蛋中透出，而蛋白质保留于袋中从而将蛋白质纯化，这种方法称为白质纯化，这种方法称为透析透析（三）透析（三）透析透析工作图透析工作图半透膜原理半透膜原理层析种类：层析种类：凝胶过（分子筛）凝胶过（分子筛）离子交换层析（阴离子和阳离子）离子交

16、换层析（阴离子和阳离子）亲和层析亲和层析(四四)层析层析带正电荷多蛋带正电荷多蛋白紧密结合白紧密结合带负电荷多蛋带负电荷多蛋白流过层析柱白流过层析柱阳阳离离子子交交换换树树脂脂工工作作示示意意图图分子筛层析分子筛层析亲亲和和层层析析工工作作示示意意图图蛋白质蛋白质载体介质载体介质配体配体结合结合洗脱洗脱洗脱介质洗脱介质(六六)超速离心超速离心三、多肽链中氨基酸的顺序分析三、多肽链中氨基酸的顺序分析第一步：第一步：分离提纯蛋白质分离提纯蛋白质 ，测定，测定NHNH2 2末端的数末端的数目，确定蛋白质分子是目，确定蛋白质分子是 由几条肽链构成的，并由几条肽链构成的，并分离出分离出 每条肽链。测定肽

17、链的分子量每条肽链。测定肽链的分子量,计算组成计算组成该肽链的氨基酸残基数。该肽链的氨基酸残基数。及每种及每种aaaa的百分组成。的百分组成。一般过程：一般过程：肽链分子中氨基酸残基数肽链分子中氨基酸残基数=肽链的分子量肽链的分子量120120 （各种的氨基酸残基的平均分子量为（各种的氨基酸残基的平均分子量为120120）再将肽链彻底水解，用离子交换层析法将各种再将肽链彻底水解，用离子交换层析法将各种的氨基酸分离的氨基酸分离a.a.丹磺酰氯法丹磺酰氯法 丹磺酰氯是一种强荧光剂，它能专一丹磺酰氯是一种强荧光剂，它能专一地与链地与链N-N-端端-氨基反应生成丹磺酰氨基反应生成丹磺酰-肽，肽，后者水

18、解生成的丹磺酰后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定出出N-N-端是何种氨基酸。端是何种氨基酸。第二步第二步 测定肽链的氨基末端和羧基末端测定肽链的氨基末端和羧基末端1.N1.N末端的测定末端的测定b b.二硝基苯氟法二硝基苯氟法：过时过时2.C2.C末端的测定末端的测定常用羧基肽酶法常用羧基肽酶法 羧基肽酶专一地将肽链水解成片羧基肽酶专一地将肽链水解成片断，分别进行顺序分析断，分别进行顺序分析第三步第三步 肽链的局部水解肽链的局部水解胰蛋白酶的作用原理胰蛋白酶的作用原理1.1.酶解法酶解法CNBr与Met反应测定

19、Pr的一级结构 2.2.化学法化学法层析鉴定就可层析鉴定就可N-N-端开始确定被测肽段的氨基酸排列顺序端开始确定被测肽段的氨基酸排列顺序第四步第四步 肽段氨基酸顺序分析肽段氨基酸顺序分析一般采用一般采用 EdmanEdman降解法降解法弱碱条件弱碱条件异硫氰酸苯酯异硫氰酸苯酯+N N端端-氨基氨基苯氨基硫甲酰肽苯氨基硫甲酰肽(PTC-(PTC-肽）肽）酸性条件酸性条件环化环化水解水解苯乙内酰硫氨基酸苯乙内酰硫氨基酸(PTH-(PTH-aaaa)失去原失去原N-N-端氨基酸的肽端氨基酸的肽剩下的肽可反复进行上述处理，依次生成各种剩下的肽可反复进行上述处理，依次生成各种PTH-PTH-aaaa，E

20、dmanEdman降解法的示意图降解法的示意图 一般常用多种方法使肽链断裂，一般常用多种方法使肽链断裂，并分析出各肽段中的氨基酸顺序。由并分析出各肽段中的氨基酸顺序。由于在不同部位断链，只要找出多套肽于在不同部位断链，只要找出多套肽段的重叠部位，然后组合排列对比，段的重叠部位，然后组合排列对比，即可推断肽段的排列顺序，从而得出即可推断肽段的排列顺序，从而得出完整肽链中氨基酸的顺序完整肽链中氨基酸的顺序第五步第五步 肽链一级结构的确定肽链一级结构的确定则其氨基酸排列顺序为：则其氨基酸排列顺序为：ThrThr-Asn-Val-Lys-Ala-Trp-Gly-lys-Asn-Val-Lys-Ala-

21、Trp-Gly-lys如测一个九肽如测一个九肽测得测得N N端氨基酸残基为端氨基酸残基为ThrThr又分别测得片段又分别测得片段:Ala-Ala-Ala-Ala-TrpTrp-Gly-Lys-Gly-Lys Val-Val-LysLys-Ala-Ala-TrpAla-Ala-TrpThrThr-Asn-Asn-Val-LysVal-Lys另外，亦可以通过基因中核苷酸顺序推测蛋白另外，亦可以通过基因中核苷酸顺序推测蛋白质的氨基酸顺序质的氨基酸顺序四、蛋白质空间结构的测定四、蛋白质空间结构的测定 1.X1.X射线晶体衍射法射线晶体衍射法 X-X-衍射图代表射线穿过（蛋白质）晶体的衍射图代表射线穿过

22、（蛋白质）晶体的一系列平行剖面的各原子的电子密度，然后再一系列平行剖面的各原子的电子密度，然后再借助计算机绘制出三维的电子密度图借助计算机绘制出三维的电子密度图2.2.二维磁共振技术二维磁共振技术3.3.蛋白质空间结构的预测蛋白质空间结构的预测（1 1）根据分子力学、分子动力学、物理化学原）根据分子力学、分子动力学、物理化学原理，从理论上计算推测蛋白质的空间结构理，从理论上计算推测蛋白质的空间结构（2 2）从已知蛋白空间结构规律，从一级结）从已知蛋白空间结构规律，从一级结构推测空间结构构推测空间结构Part 1 练习1.组成蛋白质的基本单位是什么？2.什么是等电点？Part 2 练习练习 分子筛层析时，先流出的是较大分子筛层析时，先流出的是较大的蛋白还是较小的蛋白？的蛋白还是较小的蛋白？