第三章 免疫球蛋白.ppt

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1、第三章 免疫球蛋白免疫球蛋白（免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）是指具）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。抗体（抗体（antibody,Ab)是是B细胞识别抗原后增殖细胞识别抗原后增殖分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在分化为桨细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，于血清等体液中，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能具有免疫功能.与抗体有关的诺贝尔奖获得者与抗体有关的诺贝尔奖获得者19011901von Beringvon Bering血清治疗血清治疗19081908Ehrlich&Eh

2、rlich&MetchnikoffMetchnikoff抗体生成、吞噬抗体生成、吞噬19721972Edelman&Edelman&PoterPoter抗体分子结构抗体分子结构19771977YalowYalow放射免疫测定放射免疫测定19841984Koler,MilsteinKoler,Milstein&JerneJerne单克隆抗体单克隆抗体19871987TonegawaTonegawaIgIg基因结构基因结构免疫球蛋白与抗体的关系免疫球蛋白与抗体的关系所所有有的的抗抗体体都都是是免免疫疫球球蛋蛋白白，但但并并非非所所有有的的免免疫球蛋白都是抗体。疫球蛋白都是抗体。免免疫疫球球蛋蛋白白

3、是是结结构构和和化化学学上上的的概概念念，抗抗体体是是生生物学和功能上的概念。物学和功能上的概念。IgIg可分为二类：可分为二类：分分泌泌型型(secreted(secreted IgIg，sIgsIg)：存存在在于于体体液液(血血清清、组组织液织液,外分泌液外分泌液)。膜型膜型(membrane(membrane IgIg，mIgmIg)：即：即B B细胞膜上的抗原受体。细胞膜上的抗原受体。第一节第一节第一节第一节 免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构免疫球蛋白的结构一、免疫球蛋白的基本结构一、免疫球蛋白的基本结构四四肽肽链链结结构构 所所有有Ig的的基基本本单单位位都都是是四四

4、条条肽肽链链的的对对称称结结构构。两两条条重重链链（H）和和两两条条轻轻链链（L）。每每条条重重链链和轻链分为氨基端和羧基端。和轻链分为氨基端和羧基端。人类人类Ig根据其重链稳定区的分子结构和抗原根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE，其重链分别为：其重链分别为：、轻链可分为两型：轻链可分为两型：、型型IgIgIg的两条长链称为重链（的两条长链称为重链（的两条长链称为重链（的两条长链称为重链（的两条长链称为重链（的两条长链称为重链（Heavy chain,HHeavy chain,HHeavy chain,H链）链

5、）链）链）链）链）重链可分为重链可分为重链可分为重链可分为重链可分为重链可分为 、链链链链链链 IgIg的两条短链称为轻链（的两条短链称为轻链（的两条短链称为轻链（的两条短链称为轻链（Light chain,LLight chain,L链）链）链）链）可分为可分为可分为可分为、型。每个型。每个型。每个型。每个IgIg分子的两条轻链完全相同。分子的两条轻链完全相同。分子的两条轻链完全相同。分子的两条轻链完全相同。IgM IgG IgA IgD IgE 可变区可变区 根据氨基酸排列顺序的不同分为可根据氨基酸排列顺序的不同分为可变区（变区（V）和恒定区（和恒定区（C）。）。比较不同抗体比较不同抗体V

6、区的区的氨基酸序列，发现氨基酸序列，发现VH和和VL各有各有3个区域的氨基酸个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化，这些区域称为组成和排列顺序特别易变化，这些区域称为高变高变区区。三个高变区共同组成。三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位，该的抗原结合部位，该部位也称为互补性决定区部位也称为互补性决定区.恒定区恒定区 重链和轻链的重链和轻链的C区分别称为区分别称为CH和和CL，不同类不同类Ig的重链的重链CH长度不一，同长度不一，同一种属动物中，同一类别一种属动物中，同一类别Ig分子分子C区氨基区氨基酸的组成和排列顺序比较恒定。酸的组成和排列顺序比较恒定。铰链区铰链区 位于位于CH1与与CH2之

7、间，含有丰富的之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，而且易被木瓜脯氨酸，因此易伸展弯曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。蛋白酶、胃蛋白酶等水解。免疫球蛋白的结构高变区高变区二、免疫球蛋白的功能区二、免疫球蛋白的功能区二、免疫球蛋白的功能区二、免疫球蛋白的功能区每个功能区约由每个功能区约由110个氨基酸组成，其氨基个氨基酸组成，其氨基酸的序列具有相似形或同源性。其二级结构酸的序列具有相似形或同源性。其二级结构是反向平行的是反向平行的片层片层IgG,IgA,IgD:L chain:VL,CL H chain:VH,CH1,CH2,CH3IgM,IgE:L chain:VL,CL H chai

8、n:VH,CH1,CH2,CH3,CH4功能区的作用功能区的作用VL,VH:超变区，互补决定区（超变区，互补决定区（CDR):与抗原特异与抗原特异 性结合部位性结合部位CL，CH1:同种异型的遗传标记同种异型的遗传标记CH2,CH3(IgM):补体补体C1q结合点，激活补体结合点，激活补体IgG CH2:通过胎盘通过胎盘IgG CH3:与单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、与单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、细胞、B细胞表面的细胞表面的Fc R结合。结合。IgE CH2和和CH3：与肥大细胞和嗜碱性性粒细胞与肥大细胞和嗜碱性性粒细胞 表面的表面的IgE Fc结合结合铰链区：铰链区：适于适于

9、V区同抗原的结合区同抗原的结合。含大量脯氨酸，富有弹性。含大量脯氨酸，富有弹性和伸展性，能使和伸展性，能使AbAb与不同距离的抗原决定簇结合，也利于暴露补与不同距离的抗原决定簇结合，也利于暴露补体结合位点。体结合位点。三、免疫球蛋白的水解片段三、免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶水解木瓜蛋白酶水解IgG 得到两个相同的得到两个相同的Fab段和一个段和一个Fc段。段。胃蛋白酶裂解胃蛋白酶裂解IgG 得到一个具有双价活得到一个具有双价活性的性的F（ab）2段和若干个小分子多肽碎段和若干个小分子多肽碎片（片（pFc）四、四、J链和分泌片链和分泌片（一）连接链（一）连接链（J J链）链）由浆细胞合成的一种

10、糖蛋白。由浆细胞合成的一种糖蛋白。IgAIgA和和IgMIgM含有含有J J链链 可稳定可稳定IgIg多聚体的成份多聚体的成份（二）分泌片（二）分泌片 是分泌型是分泌型IgA(sIgAIgA(sIgA）的一个辅助成分，由的一个辅助成分，由粘膜上皮细胞合成和分泌。粘膜上皮细胞合成和分泌。保护保护sIgAsIgA的铰链区免受蛋白酶的水解破坏的铰链区免受蛋白酶的水解破坏 介导介导IgAIgA二聚体的转运二聚体的转运第二节第二节 免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能V区的功能：区的功能：主要功能是识别和特异性的结合抗原，是主要功能是识别和特异性的结合抗原，是V区特别区特别是是HVR（CDR）的空间构型所决

11、定的空间构型所决定 Ig单体可结合两个抗原表位，为双价单体可结合两个抗原表位，为双价 Ab+Ag发挥免疫效应发挥免疫效应 B细胞膜表面的细胞膜表面的IgM和和IgD是是B细胞识别抗原的受体细胞识别抗原的受体C区的功能：区的功能：激活补体激活补体 IgM，IgG13 +Ag 结合细胞表面的结合细胞表面的Fc受体受体 调理作用调理作用、ADCC作用作用、介导介导I型超敏反应型超敏反应 穿过胎盘和黏膜穿过胎盘和黏膜 BACK或其它大分子细或其它大分子细菌代谢产物抗原菌代谢产物抗原细菌细菌1.抗原抗体复抗原抗体复合物合物2.结合细胞结合细胞调理吞噬作调理吞噬作用用肥大细胞脱肥大细胞脱颗粒颗粒4.炎症反

12、映炎症反映3.激活补体激活补体介导杀伤介导杀伤抗独特型抗体抗独特型抗体 抗体的抗原结合部位（抗体的抗原结合部位（antigen binding site）是抗是抗原三维结构的原三维结构的“映象映象”。抗体的这一独特氨基酸结构称抗体的这一独特氨基酸结构称为为独特型独特型（idiotype）。将某一抗体注射到另一个动物体内，可产生这一抗将某一抗体注射到另一个动物体内，可产生这一抗体的体的抗独特型的抗体抗独特型的抗体（anti-ids）。这一抗体这一抗体“模仿模仿”了抗原三维结构，可被用于作为疫苗。了抗原三维结构，可被用于作为疫苗。把抗独特型的抗体作为疫苗注入人体，可产生把抗独特型的抗体作为疫苗注入

13、人体，可产生抗抗-抗独抗独特型的抗体特型的抗体（anti-anti-idiotype antiobodies），它识别的它识别的结构与病毒（抗原）的结构相似，具有潜在的中和病毒的可能性。结构与病毒（抗原）的结构相似，具有潜在的中和病毒的可能性。即：对乙型肝炎表面抗原（即：对乙型肝炎表面抗原（hepatitis B S antigen）反应的抗反应的抗体的抗独特型抗体可激发抗病毒的抗体。体的抗独特型抗体可激发抗病毒的抗体。IgGIgG于出生后于出生后3 3个月开始合成个月开始合成IgGIgG为为单单体体，半半衰衰期期约约2323天天，血血清清含含量量最最高高，占占血血清清免免疫疫球球蛋蛋白白总总

14、量量的的75%75%，是是血血清清中中主主要要的抗感染抗体。的抗感染抗体。IgG1IgG1、IgG2IgG2和和IgG3IgG3的的CH2CH2能能通通过过经经典典途途径径激激活活补体。补体。一、一、IgGIgG第三节第三节 五类五类IgIg的特性与功能的特性与功能IgGIgG是唯一能通过胎盘的抗体是唯一能通过胎盘的抗体通通过过FcFc段段与与吞吞噬噬细细胞胞表表面面FcRFcR结结合合，发发挥挥调调理理作作用用；与与NKNK细细胞胞结结合合，发发挥挥ADCCADCC作作用用；与与葡葡萄萄球球菌菌A A蛋蛋白白结结合合，可可用用于于免免疫疫学学诊诊断和断和IgGIgG抗体的纯化。抗体的纯化。具

15、有抗菌、抗毒素和抗病毒作用具有抗菌、抗毒素和抗病毒作用参与参与、型超敏反应型超敏反应二、二、IgMIgM五五聚聚体体，是是分分子子量量最最大大的的IgIg，又又称称为为巨巨球球蛋白。蛋白。个个体体发发育育过过程程最最早早产产生生的的抗抗体体，胚胚胎胎晚晚期期开开始始合合成成，新新生生儿儿脐脐带带血血中中IgMIgM水水平平升升高高，提示胎儿曾有宫内感染。提示胎儿曾有宫内感染。IgMIgM激活补体能力比激活补体能力比IgGIgG强强天然血型抗体天然血型抗体IgMIgM在在早早期期免免疫疫防防御御过过程程发发挥挥重重要要作作用用，是是血液中抗感染的主要抗体。血液中抗感染的主要抗体。IgMIgM是是

16、抗抗原原刺刺激激后后出出现现最最早早的的抗抗体体，故故检检测测IgMIgM水平可用于传染病的早期诊断。水平可用于传染病的早期诊断。膜膜IgMIgM是是B B细胞抗原受体的主要成分细胞抗原受体的主要成分参与参与、型超敏反应型超敏反应 J J 链链 IgMIgM 的结构的结构IgMIgM J J 链链两种两种IgMIgM的比较的比较分泌型分泌型IgMIgM膜型膜型IgMIgMmIgMmIgM Iga a Igb b Iga a Igb b分泌型分泌型IgAIgA(双体双体)n n血血 清清 型型 IgAIgA(单单体体)n n分分泌泌型型IgA(sIgAIgA(sIgA，双双体体)n nsIgAs

17、IgA是是 局局 部部 和和粘粘膜膜免免疫疫的的主主要要IgIgJ chainJ chainSC四、四、IgDIgDIgDIgD是是B B细细胞胞的的重重要要表表面面标标志志未成熟未成熟B B细胞仅表达细胞仅表达mIgMmIgM成成熟熟B B细细胞胞同同时时表表达达mIgMmIgM和和mIgDmIgD活活化化B B细细胞胞或或记记忆忆B B细细胞胞表表面的面的mIgDmIgD逐渐消失逐渐消失膜膜型型IgDIgD是是B B细细胞胞表表面面的的抗抗原受体原受体(BCR)(BCR)IgDIgD分子的结构分子的结构五、五、IgEIgE又称亲细胞抗体又称亲细胞抗体CH2CH2和和CH3CH3功功能能区区

18、可可与与肥肥大大细细胞胞、嗜嗜碱碱性性粒粒细细胞胞上上的的高高亲亲和和力力FcFc受受体体（FcR1FcR1）结结合合，引引起起I I型型超超敏反应敏反应。第四节第四节 单克隆抗体和多克隆抗体单克隆抗体和多克隆抗体一一多克隆抗体多克隆抗体二二 用抗原免疫动物后获得的免疫血清（抗血清）用抗原免疫动物后获得的免疫血清（抗血清）三三 由不同克隆的由不同克隆的B B细胞针对不同抗原决定簇细胞针对不同抗原决定簇四四 所产生。所产生。多克隆抗体多克隆抗体 多个抗原决定基多个抗原决定基机体机体多多种抗体的混合物种抗体的混合物单克隆抗体（单克隆抗体（monoclonal antibody）为只针为只针对某一特

19、定的抗原决定基，纯度高的抗体对某一特定的抗原决定基，纯度高的抗体 二二 单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体概念：每一克隆B细胞所产生的理化性状高度均一、组成均一、只与同一种抗原决定族反应的抗体，称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）。杂交瘤技术制备单克隆抗体流程动物免疫分离脾细胞制备骨髓瘤细胞细胞融合HAT培养基选择杂交瘤细胞阳性孔克隆化并扩大培养再次克隆克隆扩大培养扩大培养收集上清液动物接种收集腹水单克隆抗体纯化保存ELISA测血清单克隆抗体的基本技术单克隆抗体的基本技术1.1.抗原提纯与动物免疫：抗原提纯与动物免疫：抗原纯度高：电泳纯抗原纯度高：电泳纯与骨髓瘤细胞同

20、源的与骨髓瘤细胞同源的BALB/cBALB/c小鼠小鼠2.2.细胞的选择：细胞的选择：A A 经过抗原免疫的经过抗原免疫的B B细胞（脾细胞）。细胞（脾细胞）。B B 肿瘤细胞肿瘤细胞(多发性骨髓瘤细胞多发性骨髓瘤细胞:Sp2/0:Sp2/0）。）。3.3.细胞融合：细胞融合：融合剂：聚乙二醇融合剂：聚乙二醇 (PEG,(PEG,常用聚合度常用聚合度1000200010002000浓度浓度w/vw/v：40%)40%)细胞比例：细胞比例：1:21:101:21:10，常用，常用1:41:4。反应时间：。反应时间：24min24min。4.4.培培养养基基的的选选择择：HATHAT培培养养基基。

21、含含有有三三种种关关键键成成分分：次次黄黄嘌嘌呤呤(hypoxanthine,Hhypoxanthine,H)氨氨甲甲蝶蝶呤呤(aminopterin,Aaminopterin,A)和和胸胸腺腺嘧啶核苷嘧啶核苷(thymidine,Tthymidine,T).).5.5.细胞的细胞的DNADNA合成一般有两条途径：合成一般有两条途径：A A：由由糖糖和和氨氨基基酸酸合合成成核核苷苷酸酸，进进而而合合成成DNADNA，叶叶酸酸作作为为重重要的辅酶参与反应。要的辅酶参与反应。B B：在在次次黄黄嘌嘌呤呤和和胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷存存在在下下，经经次次黄黄嘌嘌呤呤磷磷酸酸核核糖糖转转化化酶酶(HG

22、PRT)(HGPRT)和和胸胸腺腺嘧嘧啶啶核核苷苷激激酶酶(TK)(TK)的的催催化化下下合合成成DNADNA。6.HAT6.HAT培养基的选择原理：培养基的选择原理：氨氨甲甲蝶蝶呤呤(A)(A)是是叶叶酸酸拮拮抗抗剂剂，可可阻阻断断细细胞胞利利用用正正常常途途径径合合成成DNADNA，细细胞胞在在含含有有氨氨甲甲蝶蝶呤呤的的培培养养基基中中不不能能通过正常途径合成通过正常途径合成DNADNA。瘤瘤细细胞胞是是HGPRTHGPRT酶酶阴阴性性细细胞胞，自自身身不不能能通通过过替替代代途途径合成径合成DNADNA而繁殖。而繁殖。B B细细胞胞虽虽含含有有HGPRTHGPRT，但但不不能能在在体体

23、外外培培养养存存活活（只只存活存活57d57d，且功能下降且功能下降)。融融合合细细胞胞含含有有B B细细胞胞和和瘤瘤细细胞胞，其其中中瘤瘤细细胞胞核核利利用用B B细胞的细胞的HGPRTHGPRT酶进行旁路合成酶进行旁路合成DNADNA而存活。而存活。7.7.克隆化并扩大培养克隆化并扩大培养(单细胞培养称为克隆化单细胞培养称为克隆化)：有有限限稀稀释释法法:将将细细胞胞悬悬液液逐逐次次稀稀释释后后加加入入培培养养孔孔(36%(36%的的孔孔为为1 1个个细细胞胞/孔孔)，可可获获得得单单个个细细胞胞形形成成的的克克隆隆，选选择择高高分分泌抗体的细胞株扩大培养或冻存。泌抗体的细胞株扩大培养或冻

24、存。显微操作法：在倒置显微镜下吸出单个细胞培养。显微操作法：在倒置显微镜下吸出单个细胞培养。软琼脂平板法：下饲养软琼脂平板法：下饲养/上融合上融合C,C,分层培养后用分层培养后用法法细胞分选仪法：流式细胞仪分选。细胞分选仪法：流式细胞仪分选。8.8.单克隆抗体的制备、纯化：单克隆抗体的制备、纯化：A A 体外细胞株扩大培养，取上清液提纯。体外细胞株扩大培养，取上清液提纯。B B 接种小鼠腹腔，取腹水提纯。接种小鼠腹腔，取腹水提纯。C C 纯化按抗体纯化步骤进行。纯化按抗体纯化步骤进行。9.9.细胞株冻存和复苏：加小牛血清或细胞株冻存和复苏：加小牛血清或16401640培养液配成培养液配成终浓度

25、终浓度10%10%的二甲亚砜的二甲亚砜(DMSO)(DMSO)冻存液后液氮冻存液后液氮(-196 (-196 )保存。原则是：慢冻保存。原则是：慢冻(逐步降温，以每分钟降逐步降温，以每分钟降11为为宜宜)，快融，快融(立即浸入立即浸入3740 3740 水浴水浴)。10.10.注意事项：注意事项：用降植烷用降植烷(pristanepristane)等油类制剂，反复注入等油类制剂，反复注入BALB/CBALB/C小鼠腹小鼠腹强腔，可诱发产生小鼠骨髓瘤细胞。这种细胞在适宜培养强腔，可诱发产生小鼠骨髓瘤细胞。这种细胞在适宜培养条件下，具有无限繁殖能力，选择本身不会产生条件下，具有无限繁殖能力，选择本

26、身不会产生IgIg(SP2/O(SP2/O和小鼠骨髓瘤和小鼠骨髓瘤653653细胞株细胞株)的对数期生长细胞作为融合细胞。的对数期生长细胞作为融合细胞。选择缺乏选择缺乏HGPRTHGPRT或或TKTK的细胞：的细胞：A A 采用毒性药物采用毒性药物8-8-氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤(8-azaguanine,8-AG)(8-azaguanine,8-AG)选育出选育出缺乏缺乏HGPRTHGPRT的细胞的细胞(因为因为HGPRT+HGPRT+细胞利用细胞利用8-AG8-AG后后合成毒性核合成毒性核苷酸而死亡，只有苷酸而死亡，只有HGPRT-HGPRT-细胞才能存活），培养过程中有细胞才能存活），培养过程中

27、有个别细胞出现返祖现象，故应定期用个别细胞出现返祖现象，故应定期用1520ug/ml1520ug/ml的的 8-AG8-AG处处理细胞。理细胞。B B 或利用或利用5-5-溴脱氧尿嘧啶溴脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,(5-bromodeoxyuridine,BudRBudR)诱发缺乏诱发缺乏TKTK的细胞。一般选育缺乏的细胞。一般选育缺乏TKTK的细的细胞较困难。胞较困难。采用饲养细胞：在体外培养条件下，单个或少数采用饲养细胞：在体外培养条件下，单个或少数分散的细胞不易顺利生长繁殖。当加入一定量的分散的细胞不易顺利生长繁殖。当加入一定量的其他活细胞后，常可促进原有细胞的繁

28、殖，这种其他活细胞后，常可促进原有细胞的繁殖，这种加入的细胞即称为饲养细胞，可用普通小鼠脾细加入的细胞即称为饲养细胞，可用普通小鼠脾细胞胞/腹腔细胞腹腔细胞/胸腺细胞、大鼠和豚鼠的腹腔细胞，胸腺细胞、大鼠和豚鼠的腹腔细胞，最常用普通小鼠腹腔细胞。最常用普通小鼠腹腔细胞。单克隆抗体的应用：单克隆抗体的应用：1.1.诊断诊断(检测检测)试剂：病原体、肿瘤标志物、细胞表面标志试剂：病原体、肿瘤标志物、细胞表面标志等等2.2.治疗：治疗：A A 移植物受者使用移植物受者使用T T细胞的细胞的McAbMcAb，可，可预防急性排斥反应。预防急性排斥反应。B B 供体骨髓在体外经供体骨髓在体外经T T细胞的

29、细胞的McAbMcAb处理，可减轻或消除移植处理，可减轻或消除移植物抗宿主反应。物抗宿主反应。C AIDSC AIDS治疗治疗D D 肿瘤介入治疗：细胞毒剂肿瘤介入治疗：细胞毒剂(药物药物)与抗肿瘤抗原的与抗肿瘤抗原的McAbMcAb结结合后，利用合后，利用McAbMcAb的的导向作用，将细胞毒剂导向作用，将细胞毒剂(药物药物)定位于定位于肿瘤细胞，到达直接杀死肿瘤细胞的目的。肿瘤细胞，到达直接杀死肿瘤细胞的目的。应用应用 临床检测、抑制器官移植排斥、治疗临床检测、抑制器官移植排斥、治疗自身免疫疾病、生物导弹等自身免疫疾病、生物导弹等思考题思考题1 1抗体和免疫球蛋白的概念抗体和免疫球蛋白的概念2 2 图示免疫球蛋白的基本结构、功能区以及功能图示免疫球蛋白的基本结构、功能区以及功能3 3 简述免疫球蛋白的生物学活性简述免疫球蛋白的生物学活性4 4 免疫球蛋白的血清型有那些？免疫球蛋白的血清型有那些？5 5 试述各类免疫球蛋白的特性和功能试述各类免疫球蛋白的特性和功能6 6 什么是单克隆抗体和多克隆抗体？什么是单克隆抗体和多克隆抗体？