实时定量PCR简介.ppt

《实时定量PCR简介.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实时定量PCR简介.ppt（18页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、Real-timeQuantityPCRNJSunshine李文李文2005.11.17实时定量PCR简介定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点。实时定量实时定量PCR的两个重要概念的两个重要概念（1 1）荧光域值（）荧光域值（thresholdthreshold）：）：以以PCRPCR反应的前反应的

2、前1515个循环的荧个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3-153-15个循环的荧光个循环的荧光信号的标准偏差的信号的标准偏差的1010倍。倍。(2)(2)CtCt值：也称循环阈值，值：也称循环阈值，C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold。指在指在PCRPCR循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信循环次数。在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号

3、到达设定的域值的时刻号到达设定的域值的时刻,可见可见CtCt值取决于阈值。值取决于阈值。经数学证明，经数学证明，CtCt值与模板值与模板DNADNA的起始拷贝数（的起始拷贝数（dRndRn）成反比成反比。作用原理作用原理实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR常用的检测模式五种：常用的检测模式五种：（1 1）TaqManTaqMan探针探针（2 2）SYBRGreenSYBRGreen （3）LUX引物引物 (4)Molecular beacon (5)荧光谐震能量传递（荧光谐震能量传递（FRET,Roche product）SYBRGREENFRET探针Taqman分子信标LUX引物性质可逆荧光

4、积累荧光熔点分析能不能特异性引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响）引物2探针引物探针引物探针引物（非特异性扩增或引物二聚体无影响）探针不需要需要需要需要不需要通用性通用专用专用专用专用1.1.TaqManTaqMan探针方法的作用原理探针方法的作用原理:本方法的原理主要是利用本方法的原理主要是利用TaqTaq酶的酶的5353外切核酸酶活性并在外切核酸酶活性并在PCRPCR过程中反应体系加入一个荧光标记探针。过程中反应体系加入一个荧光标记探针。TaqManTaqMan探针探针55端标以荧端标以荧光发射基团，光发射基团，33端标以荧光猝灭基团。该探针在端标以荧光猝灭基团。该探针在PCRPCR过程中

5、不能被延过程中不能被延伸。当探针保持完整时，伸。当探针保持完整时，33端猝灭基团抑制端猝灭基团抑制55发射基团的荧光发射。发射基团的荧光发射。在在PCRPCR的退火期。探针与引物所包含序列内的的退火期。探针与引物所包含序列内的DNADNA模板发生特异性杂交。模板发生特异性杂交。延伸期引物在延伸期引物在TaqTaq酶作用下延酶作用下延DNADNA模板延伸，当到达探针处，模板延伸，当到达探针处，TaqTaq酶发酶发辉辉5353外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发射基团远外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发射基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密离猝灭基团

6、，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并伴有一个荧度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCRPCR产物数量是产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为扩增长度一般为5015050150bpbp。探针设计

7、一般应符合以下条件：探针设计一般应符合以下条件：(1)(1)GCGC碱基含量在碱基含量在40%-60%40%-60%。（2 2）避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G G。（3 3）避免避免55端为端为G G，因为因为G G对荧光可能有抑制作用，尽对荧光可能有抑制作用，尽量使量使C C个数多于个数多于G G。（4 4）长度应在长度应在15-2515-25个碱基左右，以保证结合的特异性。个碱基左右，以保证结合的特异性。（5 5）探针的）探针的TmTm值要比引物的值要比引物的TmTm值至少高出约值至少高出约1010。另外，探针与引物不能形成二聚体，另外，探针与引物不

8、能形成二聚体，位置与上游引物尽位置与上游引物尽量接近但不要重叠。量接近但不要重叠。(2)(2)SYBRGreenISYBRGreenI荧光染料的作用原理荧光染料的作用原理 SYBRGreenISYBRGreenI是一种只与双链是一种只与双链DNADNA小沟结合的小沟结合的染料，当它与染料，当它与DNADNA双链结合时，发出荧光；从双链结合时，发出荧光；从DNADNA双链上双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链其信号强度代表了双链DNADNA分子的数量。它的缺点是在分子的数量。它的缺点是在于能与非特异性双链于

9、能与非特异性双链DNADNA（如引物二聚体）结合，但是如引物二聚体）结合，但是其产生的干扰可能通过熔解曲线分析得到解决。其产生的干扰可能通过熔解曲线分析得到解决。这种检测方法无法应用于多重这种检测方法无法应用于多重qPCR中中(3)LUX引物引物 LUX(light upon extention)引物是利用荧光标记的引物实现定量的引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目的使用类分子信标的发夹结构设计引物，使引物同时起到一项新技术。目的使用类分子信标的发夹结构设计引物，使引物同时起到荧光探针的作。引物对中的一个引物荧光探针的作。引物对中的一个引物3端用荧光报告基团标记。在没有单端用荧光报

10、告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。使用存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。使用LUX引物，不需要专门设计探针，即省了成本又给实验设计提供了宽松的引物，不需要专门设计探针，即省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。条件。Invitrogen可以提供可以提供5中荧光标记：中荧光标记：FAM,JOE,HEX,TET and Alexa Flour 546。图.LUX引物工作原理Lux引物引物LUXTM技术的优势

11、1.通过 qPCR产品产品(1)superscript RT 可获得更高的可获得更高的cDNA产量产量和更好的特异性。和更好的特异性。(2)Platinum Taq DNA Polymerse为为PCR反应反应提供更高的特异性和产量。提供更高的特异性和产量。(3)Supermixes 包括了包括了Platinum Taq DNA 聚聚合酶和合酶和UDG及及dNTPs，ROX参照染料。参照染料。(4)SYBR Green 及及LUX引物引物qPCR 试剂盒试剂盒1.一步法一步法(1)优化于优化于ABI系统系统 SuperScript Platinum one-step qRT-PCR Kit w

12、/ROX SuperScript Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit w/ROX(2)适用于其他系统适用于其他系统 Superscript Platinum one-step qRT-PCR Kit SuperScript Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit(3)RNA UltraSense One-step Quantitative RT-PCR System 适用于超低量适用于超低量RNA摸板的灵敏扩增的摸板的灵敏扩增的QRT-PCR系统系统(4)Platinum qRT-PCR Thermoscr

13、ipt One-step System 适用于扩增具有二级结构的适用于扩增具有二级结构的RNA 2.二步法二步法(1)优化于优化于ABI系统系统 SuperScript Platinum two-step qRT-PCR Kit w/ROX SuperScript Platinum SYBR Green two-step qRT-PCR Kit w/ROX(2)适合于其他系统适合于其他系统 Superscript Platinum one-step qRT-PCR Kit SuperScript Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit(3)Superscript Platinum CellsDirect 二步法二步法 Superscript Platinum CellsDirect Two-step qRT-PCR Kit SuperScript Platinum CellsDirect Two-step qRT-PCR Kit w/SYBR Green3.SuperScript 1st cDNA合成系统合成系统 SuperScript First-Strand Synthesis superMix for qRT-PCR