第六章微生物的生长及控制.ppt

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1、第六章第六章 微生物的生长及其控制微生物的生长及其控制生物个体由小到大的增长，即表现生物个体由小到大的增长，即表现为细胞组分与结构在量方面的增加为细胞组分与结构在量方面的增加生长生长指生物个体数目的增加指生物个体数目的增加繁殖繁殖在单细胞微生物中，生长繁殖的速度很快，而且两者始终交替进行，个体生长与繁殖的界限难以划清，因此实际上常群体生长群体生长作为衡量微生物生长的指标。个体生长个体生长个体繁殖个体繁殖群体生长群体生长 群体生长个体生长个体繁殖群体生长个体生长个体繁殖 在微生物的研究和应用中，只有群体的在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有实际意义。生长才有实际意义。微生物的生长繁殖是其在

2、内外各种环境微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因素相互作用下的综合反映。群体生长的实质是包含着个体细胞生长与繁殖交替进行的过程，称之为发育。第一节第一节 测定生长繁殖的方法测定生长繁殖的方法微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。一、纯培养的分离方法（一）、稀释法l液体稀释法l固体稀释倒平板法稀释倒平板法（二）、平板划线分离法 用接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。（三）、单孢子或单细胞分离法 采取显微分离法

3、从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。在显微镜下使用在显微镜下使用单孢子分离器单孢子分离器进行机械操作，挑进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。后移到合适的培养基进行培养。（四）、选择性培养基分离法各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。微生物纯培养分离方法的比较微生物

4、纯培养分离方法的比较分离方法分离方法应用范围应用范围平皿划线法平皿划线法方法简便，多用于分离细菌方法简便，多用于分离细菌稀释倒平皿法稀释倒平皿法即可定性，又可定量，用途广泛即可定性，又可定量，用途广泛单细胞挑取法单细胞挑取法局限于高度专业化的科学研究局限于高度专业化的科学研究利用选择培养基法利用选择培养基法适适用用于于分分离离某某些些生生理理类类型型较较特特殊殊的的二、微生物生长繁殖的测定二、微生物生长繁殖的测定测定微生物生长的方法根据：生长意味着原生质含量的增加（一）测生长量1、直接法l测体积 l称干重：1mg干菌体=5-10mg湿菌体 =5-10107个菌体2、间接法 l比浊法 l生理指标

5、法 比浊法生理指标测定法常用于对微生物的快速鉴定与检测微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。与微生物生长量相平行的生理指标：含氮量含氮量、含碳量、几丁质含量、DNA、RNA等等蛋白质总量=含N量%6.25(二)计繁殖数 即计算微生物的个体数目 计繁殖数只适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子 1、直接法 所得的结果是包括死细胞在内的总菌数 a、涂片染色法 原菌液含菌数/mL=视野中平均菌数视野个数/cm2 100 稀释倍数 b、比例计数法 c、血球计数板 利用血球利用血球计数板，计数板，在显微镜在显微镜下计算一下计算一定容积里定容积里样品中微样

6、品中微生物的数生物的数量。量。缺点：缺点：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。个体小的细菌在显微镜下难以观察。原菌液含菌数原菌液含菌数/mLmL=每小每小格平均数格平均数4001000040010000稀释倍数稀释倍数2 2、间接法、间接法 原理是每个活细菌在适宜的培养基和良原理是每个活细菌在适宜的培养基和良好的生长条件下可以通过生长形成菌落。好的生长条件下可以通过生长形成菌落。所测的菌落就是待测样品所含的活菌数。所测的菌落就是待测样品所含的活菌数。平板菌落计数法 优

7、点：优点：u适用于多种材料；适用于多种材料；u菌数较少也能准确测定。菌数较少也能准确测定。缺点：缺点：u并非所有微生物在试验期间都能长出菌落；并非所有微生物在试验期间都能长出菌落；u意外的损伤可能导致菌落减少；意外的损伤可能导致菌落减少；u肉眼无法观察的菌落。肉眼无法观察的菌落。活菌指示剂：活菌指示剂：TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）氯化三苯基四氮唑）厌氧的菌落计数法l亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技术、气体喷射培养法 l厌氧手套箱培养法 用于要求严格的厌氧培养法的微生态学（正常菌群）用于要求严格的厌氧培养法的微生态学（正常菌群）的研究工作的研究工作 l厌氧罐(袋)法结合其它厌氧培养

8、方法 不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌的不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌的检验工作中，可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原检验工作中，可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原菌。菌。一、同步培养一、同步培养 概念：同步培养(synchronous culture)是一种培养方法，它能使群体中不同步的细胞转变成能同时进行生长或分裂的群体细胞。同步生长：以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长方式同步培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究的生理与遗传特性和作为工业发酵的种子，它是一种理想的材料。第二节 微生物的生长规律同步培养方法同步培养方法机械方法

9、环境条件诱导法离心方法离心方法过滤分离法过滤分离法硝酸纤维素滤膜法硝酸纤维素滤膜法温度温度培养基成份控制培养基成份控制最高稳定期的细胞接种最高稳定期的细胞接种硝硝酸酸纤纤维维素素滤滤膜膜法法离离心心法法机械法：机械法：l优点：不影响细菌代谢；优点：不影响细菌代谢；l缺点：不能用于即使是相同发育阶段个体大小不缺点：不能用于即使是相同发育阶段个体大小不一致的微生物。一致的微生物。诱导法：诱导法：l优点：方法多、应用范围广；优点：方法多、应用范围广；l缺点：对细菌代谢有影响。缺点：对细菌代谢有影响。将少量单细胞的纯培养物接将少量单细胞的纯培养物接种于一恒定容积的新鲜培养基中种于一恒定容积的新鲜培养基

10、中在合适条件下进行培养，在不补在合适条件下进行培养，在不补充营养物质或移去培养物，保持充营养物质或移去培养物，保持整个培养液体积不变条件下，以整个培养液体积不变条件下，以时间为横坐标，以菌数为纵坐标，时间为横坐标，以菌数为纵坐标，根据不同培养时间时细菌数量的根据不同培养时间时细菌数量的变化，可以作出一条反映细菌在变化，可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲整个培养期间菌数变化规律的曲线。线。生长曲线生长曲线二、单细胞微生物的典型生长曲线二、单细胞微生物的典型生长曲线 生长曲线可分：生长曲线可分：延滞期延滞期对数期对数期衰亡期衰亡期稳定期稳定期（一）延滞期（一）延滞期（lagphas

11、elagphase）特点：特点：生长速率常数等于零；生长速率常数等于零；细胞形态变大或增长；细胞形态变大或增长；细胞内细胞内RNARNA尤其是尤其是rRNArRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；含量增高，原生质呈嗜碱性；合成代谢活跃；合成代谢活跃；对外界不良条件反应敏感。对外界不良条件反应敏感。将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期、调整期。称延迟期、适应期、调整期。延滞期的出现，可能是因为在接种到新鲜培养液的细胞中，一时还缺乏分解或催化

12、有关底物的酶、辅酶或是缺乏充足的中间代谢物。为产生诱导酶或合成有关的中间代谢物，就需要有一段适应期，于是出现了生长的延滞期。出现延滞期的原因？出现延滞期的原因？影响延滞期长短的因素影响延滞期长短的因素 菌种菌种接种龄接种龄 接种量接种量 培养基成分培养基成分 在工业发酵和科研中通常采取一定的措在工业发酵和科研中通常采取一定的措施缩短延滞期：施缩短延滞期：l通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短；l利用对数生长期的细胞作为利用对数生长期的细胞作为“种子种子”；l尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太

13、大；l适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。适当扩大接种量等方式缩短迟缓期，克服不良的影响。（二）指数期（二）指数期（exponentialphaseexponentialphase）又称为对数期，是指生长曲线中紧接又称为对数期，是指生长曲线中紧接延滞期的延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。特点：特点：生长速率常数生长速率常数R R最大，因而细胞每分裂一次所需的最大，因而细胞每分裂一次所需的代时代时G G或原生质增加一倍所需的倍增时间最短；或原生质增加一倍所需的倍增时间最短；细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀；细胞进行平衡生长，菌体

14、内各种成分最为均匀；酶系活跃，代谢旺盛。酶系活跃，代谢旺盛。繁殖代数（繁殖代数（n n）繁殖代数繁殖代数 n=3.322(lgx2lgx1)12=2124=2248=23816=2416=1 24.2nx2=x1 2nlgx2=lgx1+nlg2n=（lgx2 lgx1）/lg2=3.322(lgx2 lgx1)生长速率常数（生长速率常数（R R）代时（代时（G G）例：设大肠杆菌在接种时的细胞浓度为100个/mL，经过400min的培养细胞浓度增至10亿个/mL，求该菌的繁殖代数和世代时间。解：n=3.322(lg x 2 lg x1)=3.322(lg 109 lg102)=23.2 G=

15、1/R=(t1 t2)/3.322(lg x 2 lg x1)=17.3影响指数期微生物代时的因素影响指数期微生物代时的因素 菌种菌种 营养成分营养成分 营养物浓度营养物浓度 培养温度培养温度 凡处于较低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物称为生长因子。大肠杆菌：12.5-17min枯草芽孢杆菌：26-32min嗜热乳杆菌：66-87min结核分枝杆菌：792-932min梅毒密螺旋体：1980min大肠杆菌：牛奶 12.5min 肉汤 17min产气肠杆菌：肉汤或牛奶 16-18min 组合 29-44min乳酸链球菌：牛奶 26min 乳糖肉汤 48min对数生长期的细菌个体形态、

16、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料，也是增殖噬菌体的最适宿主。对数生长期的细菌常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。（三）稳定期（三）稳定期（stationaryphasestationaryphase）特点特点生长速率常数生长速率常数R R等于等于0 0菌体产量达到了最高点菌体产量达到了最高点 菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例 关系，即，生长产量常数关系，即，生长产量常数Y Y 又称为恒定期或者最高生长期。又称为恒定期或者最高生长期。稳定期到来的原因稳定期到来

17、的原因营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，例如营养物的比例失调，例如C CN N比值不合适等；比值不合适等；酸、醇、毒素或酸、醇、毒素或H H2 2O O2 2等有害代谢产物的累积；等有害代谢产物的累积；pHpH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。稳定期的细胞行为稳定期的细胞行为细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等贮藏物；多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢；有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产

18、物；代谢产物；是乳酸等发酵生产的最佳收获期。是乳酸等发酵生产的最佳收获期。获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施：获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施：补充营养物质或取走代谢产物或改善培养补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等。条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等。（四）衰亡期（四）衰亡期（declinephasedeclinephase或或deathphasedeathphase）个体死亡的速度超过新生的速度，因此，个体死亡的速度超过新生的速度，因此，整个群体就呈现出负生长（整个群体就呈现出负生长（R R为负值）为负值）现象：现象：细菌代谢活性降低，细菌衰

19、老并出现自溶，细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。菌变成阴性反应等。特点：特点：l细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的 退化形态；退化形态；l有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶有的微生物因蛋白水解酶活力的增强就发生自溶 （autolysisautolysis）；）；l有的

20、微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生有的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生 素等次生代谢产物；素等次生代谢产物；l在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期三、微生物的连续培养三、微生物的连续培养 连续培养：连续培养：又称开放培养，当微生物以单批培养的方式培养又称开放培养，当微生物以单批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和通入无菌空气，并立即搅拌均匀；另一方面，利用溢流的方式，通入无菌空气，并立即搅拌均匀；另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。于

21、是容器内的培养物就可达到以同样的流速不断流出培养物。于是容器内的培养物就可达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和衡定的生长速率上，就形成了连续生长。和衡定的生长速率上，就形成了连续生长。连续培养器连续培养器 连续培养的基本原则：连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。同样的速率移出培养物。恒浊器（恒浊器（turbidostatturbidostat）控制培养液流速控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细

22、胞的连续培养器，可达到速度恒定的微生物细胞的连续培养器，可达到恒恒密度密度的目的，使微生物在最高生长速率下生长。的目的，使微生物在最高生长速率下生长。为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器。些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器。通过连通过连续培养续培养装置中装置中的光电的光电系统控系统控制培养制培养液中菌液中菌体浓度体浓度恒定、恒定、使细菌使细菌生长连生长连续进行续进行的一种的一种培养方培养方式。式。用于菌用于菌体以及体以及与菌体与菌体生长平生长平行的代行的代谢产物谢产物生产的生产的发酵工发酵工业业恒化器（恒

23、化器（chemostatchemostat）一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始一种设法使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置连续培养装置,又称为恒组成连续培养。又称为恒组成连续培养。通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子，控制生长速率；长限制因子，控制生长速率；可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却能保持稳定菌体密度的菌体。于最高菌体产量，却能保持稳定菌体密度的菌体。生

24、长速率的控制因子：生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质。盐，生长因子等物质。恒化器连续培养通常用于微生物学的研究工作：恒化器连续培养通常用于微生物学的研究工作：l从遗传学角度，允许作长时间的细菌培养而从中分从遗传学角度，允许作长时间的细菌培养而从中分离不同的变种；离不同的变种；l从生理学角度，能观察细菌在不同生活条件下的变从生理学角度，能观察细菌在不同生活条件下的变化；化；l从生态学角度，也是研究自然条件下微生物生态体从生态学角度，也是研究自然条件下微生物生态体系比

25、较理想的实验模型。系比较理想的实验模型。恒化器与恒浊器的比较恒化器与恒浊器的比较 单级连续培养器单级连续培养器 如果某微生物代谢产物的产生速率与菌体生如果某微生物代谢产物的产生速率与菌体生长速率相平行，就可以采用单级恒浊器来进行研长速率相平行，就可以采用单级恒浊器来进行研究或生产究或生产。多级连续培养多级连续培养 如果要生产的恰恰是与菌体生长不平行的那些如果要生产的恰恰是与菌体生长不平行的那些发酵产物，例如丙酮、丁醇等时，就应根据两者的发酵产物，例如丙酮、丁醇等时，就应根据两者的产生规律，设计与其相适应的多级连续培养装置产生规律，设计与其相适应的多级连续培养装置（各级间相互串联）。（各级间相互

26、串联）。例：丙酮丁醇梭菌的丙酮丁醇发酵例：丙酮丁醇梭菌的丙酮丁醇发酵菌体生长期：菌体生长期：3737，时间较短，只要产菌体；，时间较短，只要产菌体；产物合成期：产物合成期：3333，时间较长，只要产溶剂，时间较长，只要产溶剂 丙酮、丙酮、丁醇；丁醇；两级连续发酵罐：第一级：第一级：3737，pH4.3pH4.3，培养液稀释率，培养液稀释率0.125/h;0.125/h;第二级：第二级：3333，pH4.3pH4.3，培养液稀释率，培养液稀释率0.04/h0.04/h 两级串联两级串联连续发酵的优点连续发酵的优点 高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐高效，它简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵

27、罐等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高等许多单元操作，从而减少了非生产时间和提高了设备的利用率；了设备的利用率；自控，便于利用各种仪表进行自动控制；自控，便于利用各种仪表进行自动控制；产品质量较稳定；产品质量较稳定；节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、节约了大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均匀合理。电的负荷均匀合理。连续培养的缺点连续培养的缺点 最主要的是菌种容易退化；最主要的是菌种容易退化；其次是易遭杂菌污染；其次是易遭杂菌污染；营养物利用率一般低与单批培养营养物利用率一般低与单批培养。四、微生物的高密度培养四、微生物的高密度培养 有时也称有时也称高密度发酵高密度

28、发酵，一般是指微生，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养养1010倍以上时的生长状态或培养技术。倍以上时的生长状态或培养技术。方法：方法：选取最佳培养基成分和各成分含量；选取最佳培养基成分和各成分含量；补料；补料；提高溶氧量的浓度；提高溶氧量的浓度；防止有害代谢产物的生成。防止有害代谢产物的生成。第三节第三节影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的主要因素 影响因素：影响因素：氧 温 度 PH 值（一）温度（一）温度 生长温度的三基点生长温度的三基点 最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度 温度对微生物

29、生长的影响是通过影响微生物细温度对微生物生长的影响是通过影响微生物细胞内的生物化学反应而实现。胞内的生物化学反应而实现。“最适生长温度”，其意义是某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。最适生长温度不一定是一切代谢活动的最适温度。例：乳酸链球菌 34 繁殖速度最快 25-30 细胞产量最高 40 发酵速度最快 30 乳酸产量最高青霉素的变温培养：青霉素的变温培养：30 25 20 25 0h 5h 40h 125h 165h致死温度致死温度低温微生物：嗜冷微生物 专性嗜冷微生物 15 兼性嗜冷微生物 20 中温微生物：20-40 室温性微生物 20-25 体温性微生物 35-40 高温型微

30、生物：嗜热微生物 45-50 l专性好氧菌：专性好氧菌：需需O O2 2（20%），呼吸链，受体，呼吸链，受体O O2 2，有，有SODSOD 和过氧化氢酶；绝大多数微生物属于此类；和过氧化氢酶；绝大多数微生物属于此类；l兼性厌氧菌兼性厌氧菌：需需O O2 2，呼吸链，呼吸，呼吸链，呼吸，SODSOD和过氧化氢酶；和过氧化氢酶；无无O O2 2，发酵或无氧呼吸；，发酵或无氧呼吸；l微好氧菌：微好氧菌：低低O O2 2（2 2-1O-1O），呼吸链，受体，呼吸链，受体O O2 2，有，有 SODSOD和过氧化氢酶；和过氧化氢酶；l耐氧菌：耐氧菌：不需不需O O2 2（2），无呼吸链，发酵，有，无

31、呼吸链，发酵，有SODSOD 和过氧化物酶；和过氧化物酶；l厌氧菌：厌氧菌：厌厌O O2 2，无，无O O2 2产能，无产能，无SODSOD和过氧化氢酶。和过氧化氢酶。（二）氧气（二）氧气 自由基是一种强氧化剂，它与生物大分子互相自由基是一种强氧化剂，它与生物大分子互相作用，可导致产生生物分子自由基，从而对机体作用，可导致产生生物分子自由基，从而对机体产生损伤或突变作用，直至死亡。氧之所以对专产生损伤或突变作用，直至死亡。氧之所以对专性厌氧微生物以外的其他四种类型微生物不产生性厌氧微生物以外的其他四种类型微生物不产生致死作用，是因为它们具有超氧物歧化酶，可催致死作用，是因为它们具有超氧物歧化酶

32、，可催化起氧化基化合物分解，最终分解成水。化起氧化基化合物分解，最终分解成水。对于好氧微生物虽然可以通过好氧呼吸产生对于好氧微生物虽然可以通过好氧呼吸产生更多的能量，满足机体的生长需要，但另一方面，更多的能量，满足机体的生长需要，但另一方面，氧对一切生物都会使其产生有毒害作用的代谢产氧对一切生物都会使其产生有毒害作用的代谢产物，如超氧基化合物与物，如超氧基化合物与H H2 2O O2 2，这两种代谢产物互相，这两种代谢产物互相作用还会产生毒性很强的自由基作用还会产生毒性很强的自由基OHOH.。厌氧菌的氧毒害机制 1971年McCord和Fridovich提出SOD的学说 他们认为，厌氧菌因缺乏

33、SOD，故易被生物体内产生的超氧阴离子自由基（O2-.）毒害致死。(三三)、PHPHl引起膜电荷的变化，进而影响微生物对营养物质的吸收；l影响代谢过程中酶的活性；l改变生长环境中营养物质的可给性和有害物质的毒性。微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应微生物生长过程中机体内发生的绝大多数的反应是酶促反应，而酶促反应都有一个最适是酶促反应，而酶促反应都有一个最适pHpH范围，在此范围，在此范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生范围内只要条件适合，酶促反应速率最高，微生物生长速率最大，因此微生物生长也有一个最适生长的长速率最大，因此微生物生长也有一个最适生长的pHpH范围。范围。微生物微

34、生物最低最低PH最适最适PH最高最高PH细菌细菌3-56.5-7.58-10酵母菌酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌霉菌1-34.5-5.57-8 微生物作为一个总体来说，其生长的微生物作为一个总体来说，其生长的pHpH范围范围极广，绝大多数种类都生长在极广，绝大多数种类都生长在pH5pH59 9之间。之间。l 嗜碱微生物嗜碱微生物l 耐碱微生物耐碱微生物l 嗜酸微生物嗜酸微生物l 耐酸微生物耐酸微生物 同一微生物在其不同的生长阶段和不同一微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过程中，也有不同的最适同的生理、生化过程中，也有不同的最适pHpH要求。要求。例例1 1：黑曲霉发酵蔗糖 pH

35、2-3 柠檬酸为主 少量草酸 pH 7 草酸为主 少量柠檬酸例2：酵母菌乙醇发酵 pH 4.5-5.0 乙醇 无甘油和醋酸 pH 8 乙醇，甘油和醋酸 微生物内环境中的pH相当稳定，一般都接近中性。这样，就免除了DNA、ATP和叶绿素等重要成分被酸破坏，或RNA、磷脂类等被碱破坏。微生物对外界环境pH的改变调节pH的方法 第四节 微生物培养法概论良好的微生物培养装置的基本条件：良好的微生物培养装置的基本条件：按照微生物的生长规律进行科学的设计，能按照微生物的生长规律进行科学的设计，能在提供丰富而均匀营养物质的基础上，保证微生在提供丰富而均匀营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和良好的通气

36、等物化条件和防物获得适宜的温度和良好的通气等物化条件和防止杂菌污染等。止杂菌污染等。从少量培养发展到大规模培养；从浅层培养发展到厚层（固体）或深层（液体）培养；从以固体培养技术为主发展到以液体培养技术为主；从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养；从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养；从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化的细胞集团；从单纯利用微生物细胞到大量培养、利用高等动、植物细胞；从单菌发酵发展到混菌发酵；从利用野生菌种发展到利用变异株以及“工程菌”，等等。微生物培养技术的发展实验室培养法（一）固体培养 1好氧菌：试管斜面、培养皿平板及较大型的克氏扁平、茄子瓶等的平板培养方法。2厌

37、氧菌：（1）高层琼脂柱 （2）Hungate滚管技术 （3）厌氧培养皿 （4）厌氧罐 （5）厌氧手套箱 Hungate滚管技术 其主要原理是利用除氧铜柱来制备高纯氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配制、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证了这类严格厌氧菌的存活。Gas-pak法厌氧罐厌氧手套箱法又称厌氧室法1 1：厌氧培养罐：厌氧培养罐 2 2：混合气体（：混合气体（COCO2 2：H H2 2：N N2 2=1=1：1 1：8 8）钢瓶）钢瓶3 3：压力表：压力表 4 4：三通阀：三通阀 5 5：缓冲瓶：缓冲瓶 6 6

38、：真空泵：真空泵自自制制厌厌氧氧罐罐法法（二）液体培养（二）液体培养 1好氧菌的培养好氧菌的培养 微生物只能利用溶于水中的氧，保证在培养微生物只能利用溶于水中的氧，保证在培养液中有较高的溶解氧浓度就显得特别重要；液中有较高的溶解氧浓度就显得特别重要；对好氧菌来说，生长的限制因子几乎总是氧对好氧菌来说，生长的限制因子几乎总是氧的供应。的供应。增加溶解氧浓度的措施增加溶解氧浓度的措施浅层液体培养；浅层液体培养；利用往复式或旋转式摇床（利用往复式或旋转式摇床（shakershaker）对三角瓶培养）对三角瓶培养物作振荡培养；物作振荡培养；在深层液体培养器的底部通入加压空气，并用气体在深层液体培养器的

39、底部通入加压空气，并用气体分布器使其以小气泡形式均匀喷出；分布器使其以小气泡形式均匀喷出；对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻挡装置。挡装置。实验室进行好氧菌培养的方法：实验室进行好氧菌培养的方法：（1 1）试管液体培养）试管液体培养 （2 2）三角瓶浅层培养）三角瓶浅层培养 （3 3）摇瓶培养）摇瓶培养 （4 4）台式发酵罐）台式发酵罐 2厌氧菌的培养厌氧菌的培养 在实验室中，采用加有在实验室中，采用加有有机还原剂（如巯基有机还原剂（如巯基乙酸、半胱氨酸、维生素乙酸、半胱氨酸、维生素C C或庖肉等）或庖肉等）或或无机还原无机还原剂（铁丝等）

40、剂（铁丝等）的深层液体培养基，并在其上的深层液体培养基，并在其上封以封以凡士林凡士林-石蜡层石蜡层。如果能将其放入前述的厌氧罐或。如果能将其放入前述的厌氧罐或厌氧手套箱中培养，则效果将会更好。厌氧手套箱中培养，则效果将会更好。二、生产实践中的微生物培养装置二、生产实践中的微生物培养装置（一）固体培养（一）固体培养 1 1好氧菌的曲法培养好氧菌的曲法培养 2 2厌氧的堆积培养法厌氧的堆积培养法 在生产实践上，好氧菌的固体培养方法都是在生产实践上，好氧菌的固体培养方法都是将接过种的固体基质薄薄地摊铺在容器表面，这将接过种的固体基质薄薄地摊铺在容器表面，这样，既可使微生物获得充分的氧气，又可让微生样

41、，既可使微生物获得充分的氧气，又可让微生物在生长过程中产生的热量及时释放，这就是曲物在生长过程中产生的热量及时释放，这就是曲法培养的基本原理。法培养的基本原理。1 1好氧菌的培养好氧菌的培养（1 1）浅盘培养）浅盘培养 （2 2）利用发酵罐作深层液体培养）利用发酵罐作深层液体培养 （二）液体培养（二）液体培养2 2厌氧菌大规模的液体培养厌氧菌大规模的液体培养 迄今为止，能作大规模液体培养的厌氧菌仅迄今为止，能作大规模液体培养的厌氧菌仅局限于局限于Clostridiumaceto-butylicumClostridiumaceto-butylicum（丙酮丁醇梭（丙酮丁醇梭菌）的丙酮丁醇发酵一种

42、菌）的丙酮丁醇发酵一种 。第五节有害微生物的控制 一、几个基本概念（一）灭菌 采用强烈的理化因素使物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。（二）消毒 采用一种较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人或动、植物有害的病原菌，而以被消毒的对象基本无害的措施。（三）防腐 利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长和繁殖，即通过制菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施。（四）化疗 利用具有高度选择力即对病原菌具高度毒力而对其宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。防腐（防腐（antisepsisantisepsis）低温：低

43、温：44以下的各种低温（以下的各种低温（OO、-20-20、-70-70、-196-196等）等）缺氧缺氧:抽真空、充氮或抽真空、充氮或COCO2 2、加入除氧剂、加入除氧剂干燥：干燥：晒干、烘干、红外干燥或密封加入除湿剂晒干、烘干、红外干燥或密封加入除湿剂 高渗：高渗：盐腌盐腌 糖渍等措施糖渍等措施高酸度：高酸度：高酸度高酸度-泡菜泡菜-乳酸乳酸高醇度：高醇度：白酒或黄酒浸泡白酒或黄酒浸泡防腐剂：防腐剂：酱油中常以苯甲酸来防腐；酱油中常以苯甲酸来防腐；食品和饲料可加入二甲基延胡索酸食品和饲料可加入二甲基延胡索酸 （DMFDMF）来防腐）来防腐 化妆品中用山梨醇、脱氢醋酸等化妆品中用山梨醇、脱

44、氢醋酸等二、物理杀菌因素的代表二、物理杀菌因素的代表高温高温 能作为物理杀菌因素的种类很多，例如能作为物理杀菌因素的种类很多，例如高温、辐射、超声波和激光等，最常用的高温、辐射、超声波和激光等，最常用的为高温。为高温。高温杀菌原理高温杀菌原理 高温的致死作用，主要是由于它使微生物的高温的致死作用，主要是由于它使微生物的蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，蛋白质和核酸等重要生物高分子发生变性、破坏，例如它可使酶蛋白变性、活力丧失，核酸发生脱例如它可使酶蛋白变性、活力丧失，核酸发生脱氨、脱嘌呤或降解以及破坏细胞膜上的类脂质成氨、脱嘌呤或降解以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。分等。（一）、高温

45、杀菌作用的种类（一）、高温杀菌作用的种类 湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方面是湿热灭菌要比干热灭菌更有效，这一方面是由于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更由于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。速其变性。1 1、干热灭菌、干热灭菌火焰灼烧火焰灼烧烘箱内热空气灭菌烘箱内热空气灭菌干热灭菌干热灭菌温度温度：150-170；时间时间：1-2h对象对象：金属器械、玻璃器皿金属器械、玻璃器皿等等2 2、.湿热灭菌湿热灭菌、常压法、常压法l巴氏灭菌法巴氏灭菌法l煮沸消毒法煮沸消毒法l间歇灭菌法间歇灭菌法、

46、加压法、加压法l常规高压蒸汽灭菌法常规高压蒸汽灭菌法l连续加压蒸汽灭菌法连续加压蒸汽灭菌法高温对牛奶及其热敏感物质不适宜，因为高热破坏了食品的营养与风味。具具体体方方法法低温维持法低温维持法(LTH)：只要在：只要在63下维持下维持30min高温瞬时法高温瞬时法(HTST)：只要在：只要在72下维持下维持15s超高温法：只要在超高温法：只要在135-150下维持下维持2-6s巴氏消毒法巴氏消毒法 将待消毒物品如注射器、金属用具、解剖用具等在水中煮沸15min或更长时间，以杀死细菌或其他微生物的营养体和少部分的芽孢或孢子。煮沸消毒法煮沸消毒法如果在水中适当加如果在水中适当加1 1碳酸钠或碳酸钠或

47、2 2一一5 5的石的石炭酸则杀菌效果更好。炭酸则杀菌效果更好。对对于于某某些些培培养养基基，由由于于高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌会会破破坏坏某某些些营营养养成成分分，可可用用间间隙隙灭灭菌菌法法灭灭菌菌，即即流流通通蒸蒸汽汽(或蒸煮或蒸煮)反复灭菌几次。反复灭菌几次。常压下常压下100100处理处理15-30min15-30min。间隙灭菌法间隙灭菌法例如第一次蒸煮后杀死微生物营养体，冷却，培例如第一次蒸煮后杀死微生物营养体，冷却，培养过夜，孢子萌发，又第二次蒸煮，杀死营养体。这养过夜，孢子萌发，又第二次蒸煮，杀死营养体。这样反复样反复2-32-3次就可以完全杀死营养体和芽孢，也可保次就可以完全

48、杀死营养体和芽孢，也可保持某些营养物质不被破坏。持某些营养物质不被破坏。高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 又称为常规加压灭菌法。又称为常规加压灭菌法。高压蒸汽灭菌锅。高压蒸汽灭菌锅。通常情况下采用通常情况下采用1Kg/cm1Kg/cm2 2（1515磅磅/英寸英寸2 2）的蒸气）的蒸气压，温度压，温度121121处理处理15-30min15-30min。发酵生产中使用，让培养基在管道的流动过发酵生产中使用，让培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后流进发酵罐。程中快速升温、维持和冷却，然后流进发酵罐。135-140135-140下维持下维持5-155-15秒。秒。连续加压蒸汽灭菌法连续加

49、压蒸汽灭菌法优点：优点：有效地减少营养成分的破坏；有效地减少营养成分的破坏；所用总的时间减少，提高发酵罐的利用率；所用总的时间减少，提高发酵罐的利用率；蒸汽负荷均匀，提高了锅炉的利用率；蒸汽负荷均匀，提高了锅炉的利用率；适于自动化操作，降低了劳动强度。适于自动化操作，降低了劳动强度。衡量灭菌效果的指标衡量灭菌效果的指标 热死时间热死时间(themaldeathtime)：即在一定温度下杀死所即在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的时间。有某一浓度微生物所需要的时间。热死温度热死温度(themaldeathpoint)：即在一定的时间内，即在一定的时间内，杀死某一浓度微生物所需要的最低温度。

50、杀死某一浓度微生物所需要的最低温度。（二）影响加压蒸汽灭菌效果的因素（1 1）灭菌物体含菌量的影响）灭菌物体含菌量的影响 （2 2）灭菌锅内空气排除程度的影响灭菌锅内空气排除程度的影响 （3 3）灭菌对象）灭菌对象pHpH的影响的影响 （4 4）灭菌对象的体积）灭菌对象的体积 （5 5）加热与散热速度）加热与散热速度 检验空气排尽的方法：检验空气排尽的方法：l灭菌锅同时装有压力表和温度计；灭菌锅同时装有压力表和温度计；l将蒸汽引入深层冷水中，只有将蒸汽引入深层冷水中，只有“扑扑扑扑”声；声；l锅中加入芽孢杆菌，灭菌后检测；锅中加入芽孢杆菌，灭菌后检测；l加入适当熔点的固体试剂，灭菌后观察融化状