醋酸纤维素薄膜电泳.ppt

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1、血清蛋白质的醋酸纤维素薄血清蛋白质的醋酸纤维素薄膜电泳膜电泳 实验目的1掌握电泳的基本原理，了解电泳仪和电泳槽的功能。2熟悉电泳的基本过程与操作方法。p 电泳电泳实验原理实验原理 优点优点:快速、准确、重现性好。快速、准确、重现性好。应用应用:1.:1.分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等；分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等；2.2.分析某种物质的纯度及分子量。分析某种物质的纯度及分子量。对生物大分子而言：对生物大分子而言：电场电场力力:F=QE阻力阻力:F=6r当当电电泳达到平衡泳达到平衡时时，带电颗带电颗粒匀速运粒匀速运动动:F=FQE=6r 迁移率迁移率:即即/E，表示单位电场强度时粒

2、子运动的速度。，表示单位电场强度时粒子运动的速度。该值在该值在一定条件下决定于粒子本身的性质，即其所带电荷、大小和形状一定条件下决定于粒子本身的性质，即其所带电荷、大小和形状.6rQE=影响电泳速度的因素影响电泳速度的因素样品本身：带电量、分子大小、形状样品本身：带电量、分子大小、形状电场强度：电压电场强度：电压缓冲液：成分、缓冲液：成分、pH、离子强度、离子强度(0.02-0.2 M)支持介质：电渗作用、吸附作用支持介质：电渗作用、吸附作用温度温度负极负极正极正极 表面带负电荷表面带负电荷带正电荷的水层携带粒子向负极移动带正电荷的水层携带粒子向负极移动 如果样品应移向负极，则泳动速度加快；如

3、果样品应移向负极，则泳动速度加快；如果样品应移向正极，则泳动速度减慢。如果样品应移向正极，则泳动速度减慢。显微电泳等电聚焦电泳等速电泳密度梯度电泳电泳自由电泳(无支持体)区带电泳(有支持体)滤纸电泳(常压及高压)薄层电泳(薄膜及薄板)凝胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺)p 分类分类水平电泳槽水平电泳槽 垂直板电泳槽垂直板电泳槽圆盘电泳槽圆盘电泳槽 双向电泳双向电泳 醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维素薄膜为支持物。1.1.样品吸附极少，无拖尾现象，条带清晰。样品吸附极少，无拖尾现象，条带清晰。2.2.快速省时。快速省时。3.3.灵敏度高，样品用量少。灵敏度高

4、，样品用量少。4.4.制成透明干膜用于定量扫描分析与长期保存。制成透明干膜用于定量扫描分析与长期保存。5.5.操作简单、快速、价廉操作简单、快速、价廉.醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，将其溶于丙酮等有机溶液中，可涂布成均一细密的微孔薄膜。待有机溶剂挥发后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。染色方法染色方法 氨基黑氨基黑10B 考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250 银染色法银染色法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250 人血浆蛋白质的等电点及迁移率人血浆蛋白质的等电点及迁移率 蛋白质名称等电点泳动度/(cm2

5、V-1S-1)分子量白蛋白4.88-5.910-569,0001-球蛋白5.065.110-5200,0002-球蛋白5.064.110-5300,000-球蛋白5.12-2.810-59,000-150,000-球蛋白6.85-7.50-1.010-5156,000-300,000病名病名白蛋白白蛋白1球蛋白球蛋白2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白肾肾病病弥温性肝弥温性肝损损害害肝硬化肝硬化-桥桥原原发发性肝癌性肝癌AFP多多发发性骨髓瘤性骨髓瘤慢性炎症慢性炎症妊娠妊娠无丙种球蛋白血症无丙种球蛋白血症双白蛋白血症双白蛋白血症双峰双峰实验器材和试剂实验器材 电泳槽、电泳仪、染缸、滤纸、醋酸

6、纤维素薄膜、点样器试剂1.血清2.巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH 8.6、I=0.06)3.染色液:氨基黑10B 0.25g，甲醇50 mL+冰醋酸10 mL+水40 mL溶解(可重复使用)4.漂洗液：甲醇45 mL+冰醋酸5 mL+蒸馏水50 mL实验步骤1.1.点样面为不光滑面，勿用手触摸；点样面为不光滑面，勿用手触摸；2.2.点样量适中，垂直居中点样；点样量适中，垂直居中点样；3.3.点样端靠近电泳仪负极；点样端靠近电泳仪负极；4.4.膜条背面朝上放置，需与滤纸贴紧，拉直。膜条背面朝上放置，需与滤纸贴紧，拉直。注意事项注意事项思考题 分析影响电泳的各个因素。分析自己的实验结果，针对本实验的各项操作提出改进意见。