血清蛋白质浓度定量测定.ppt

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1、BCA 法定量蛋白质浓度nBCA法是近来广为应用的蛋白定量方法。法是近来广为应用的蛋白定量方法。n操作简便，快速，灵敏度高，准确，试操作简便，快速，灵敏度高，准确，试剂稳定性好，经济实用，抗干扰能力强剂稳定性好，经济实用，抗干扰能力强【原理】：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。【原理】：基本原理nBCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓度定法蛋白浓度定量：量：n在碱性环境下蛋白质与在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将络合并将Cu2+还原成还原成Cu+（biuret

2、reaction）。）。BCA与与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，结合形成稳定的紫蓝色复合物，在在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。n【试剂】n1、试剂试剂A：n分分别别称取称取10g BCA二二钠盐钠盐、20g无水碳酸无水碳酸钠钠、0.16g酒石酸酒石酸钠钠、4g氢氢氧化氧化钠钠、9.5g碳酸碳酸氢氢钠钠，混合，混合调调PH值值至至11.25，加水至，加水至1L。n2、试剂试剂B：4硫酸硫酸铜铜。n3、BCA工作液：工作液：n试剂试剂A 100ml 试剂试剂B 2ml混合。混合。操作步骤n1.

3、先将solutionA 摇晃混匀，根据样品数量，按50体积solution A加1体积solutionB试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。n2、蛋白质标准液：蛋白质标准液：n用结晶牛血清白蛋白用结晶牛血清白蛋白(BSA)根据其纯度根据其纯度用生理盐水用生理盐水配制成配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液的蛋白质标准液。（纯度可经凯。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定）氏定氮法测定蛋白质含量而确定）3.绘制标准曲线：n取取6支支试试管，管，编编号后分号后分别别加入加入0mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL标标准准蛋

4、白蛋白质质溶液溶液(BSA)，然后各管分，然后各管分别别用去离子用去离子水水补补充到充到0.1mL，最后各，最后各试试管中分管中分别别加入加入2.0mLBCA工作液，工作液，每加完一管每加完一管，立即立即在漩在漩涡涡混合器上混合器上混合混合（注意不要太注意不要太剧剧烈，以免烈，以免产产生大量气泡而生大量气泡而难难于消除于消除），以蛋白），以蛋白质质的的蛋白含量蛋白含量为为横坐横坐标标、吸光度、吸光度A为纵为纵坐坐标绘标绘制制标标准曲准曲线线。4.样品测定：同绘制标准曲线方法，在一支试管中加入待测样品0.1mL代替标准蛋白质溶液，然后加入2.0mLBCA工作液后，立即在漩涡混合器上混合，测吸光度

5、A，查标准曲线，求出待测样品中蛋白质浓度（g/L）。n【优缺点】n(一)操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；n(二)准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200g/ml，微量BCA测定范围在0.5-10g/ml。n(三)经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；n(四)抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响n此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前广泛选用。目前BCA法的法的试剂盒试剂盒市面有售。市面有售。n BCA蛋白浓度测定蛋白浓度测定试剂盒试剂盒

6、(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一浓度检测方法之一BCA法研制而成，实现法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。敏度和高兼容性。检测浓度下限达到检测浓度下限达到25 微微克克/毫升，最小检测蛋白量达到毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，微克，待测样品体积为待测样品体积为120微升。微升。试剂盒组成n2.稀释标准品：完全溶解蛋白质标准品（5mg/mlBSA(牛血清白蛋白),-20保存）取10微升用PBS(pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液)稀释至100微升（

7、样品一般可用PBS稀释），使终浓度为 0.5mg/ml。n将稀释后的标准品（0.5mg/ml）按0,2,4，6，8,12,16,20微升分別加到96孔板的蛋白标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升。体积(ul)02468121620终浓度（ug/ul)00.050.10.150.20.30.40.5npH7.4 pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）的配制）的配制npH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4,PBS）:nNaCI 8.0gnKH2PO4 0.2gnNa2HPO412H2O 2.9gnKCI 0.2gn将上列试剂按次序加入定量容器中，加

8、适量蒸馏水溶解后，再定容至1000mL，调pH值至7.4,高压消毒灭菌112Kpa20min，冷却后，保存于4冰箱中备用。n6孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml,n12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml,n24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml,n96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml,n摘自司徒镇强的细胞培养实实验验步步骤骤实实验验步步骤骤n3、待测样品：用双缩脲测定法的样品待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。稀释而成。n此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前作者广泛选用。目前BCA法的法的试剂盒试剂盒

9、市市面有售。面有售。n总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。条件决定。n【试剂】n1、试剂A：1BCA二钠盐 n2无水碳酸钠 n0.16%酒石酸钠 n0.4氢氧化钠 n0.95碳酸氢钠 n混合调PH值至11.25。n2、试剂B：4硫酸铜。n3、BCA工作液：试剂A 100ml 试剂B 2ml混合。n4、蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋

10、白质含量而确定）n5、待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。n此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。n总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。实实验验步步骤骤n加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液不足道20ul。即：将蛋白质样品作适当稀释（最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释n 4.各孔加入200微升BCA工作液，用加样枪轻轻吹打混匀（注意：不要弄出气泡影响读数），37放置30-60分钟。n冷却到室温后，用酶标仪测定A562nm，或540-590nm之间的其他波长的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白浓度。n【计算】n（一）绘制标准曲线。n（二）以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。n（三）再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。