胰蛋白酶的活力的测定.ppt

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1、胰蛋白酶的活力的测定胰蛋白酶的活力的测定一、酶的化学本质一、酶的化学本质 概念概念 是一是一类生物催化生物催化剂。化化学学本本质 绝大大多多数数酶是是蛋蛋白白质，某某些些RNARNA或或DNADNA也也具具有催化活性。有催化活性。二、酶的化学组成二、酶的化学组成蛋白质的酶单纯蛋白质的酶全酶酶蛋白apoenzyme辅助因子cofactor辅助因子助因子辅基基/辅酶小分子有机化合物、金属离子，直接参小分子有机化合物、金属离子，直接参加反加反应。直接对电子、原子或某些化学集团起传递作用。直接对电子、原子或某些化学集团起传递作用。酶蛋白蛋白决定反决定反应特异性特异性（专一性）（专一性）。一种一种辅助因

2、子可与多种助因子可与多种酶蛋白蛋白结合；一种合；一种酶蛋白只能与一种蛋白只能与一种辅助因子助因子结合。合。三三、酶的活性中心的活性中心必需基团必需基团 酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。活性中心活性中心 酶分子中必需基团相对集中，构成一定空间结构区域，与催化作用直接相关。活性中心结合部位 （底物）催化部位（底物的键在此处被打断或形成新的键）用于判断和确定酶活型中心的主要方法：用于判断和确定酶活型中心的主要方法：1、专一性研究 通过研究酶的专一性底物的结构特点，来判断 和确定活性中心的结构特点。2、酶侧链基团的化学修饰法 酶分子中可以被化学修饰的基团 很多，如巯基、羟基、咪唑基、氨

3、基及羧基 等。四四、酶的命名与分的命名与分类习惯命名法习惯命名法按催化反按催化反应类型分型分类脱氢酶、脱羧酶、连接酶、聚合酶等。按按组织来源及性来源及性质分分类胃蛋白酶/胰蛋白酶，酸性/碱性磷酸酶等。国际系统分类国际系统分类 酶原与酶原激活酶原与酶原激活 无活性的酶前身物称酶原。由无活性酶原转变为有活性酶的过程称酶原激活。同工酶同工酶 分子结构不同、理化性质也不同，但催化同一化学反应的一组酶，如乳酸脱氢酶（LDH）。别位酶别位酶 多亚基组成，其中有催化亚基、有调节亚基，小分子化合物结合调节亚基后分子构象改变，引起催化活性改变。五、酶的活力测定五、酶的活力测定 酶活力（酶活力（enzyme ac

4、tivityenzyme activity），是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力单位酶活力单位（国际单位）标准状态下，每分钟使一微克分子作用物发生转变的酶量。人们普遍采用是习惯用法，如a-淀粉酶，可用每小时催化1克可溶性淀粉所需要的酶量来表示。胰胰蛋蛋白白酶酶活活力力单单位位的的定定义义规规定定为为：以BAEE为底物反应液pH8.0，25，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定A253，每分钟使A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。初速度初速度 研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准研究酶反应的动力学以酶促反应的初速度为准酶活力与酶反应速度 时间以N-苯甲酰-

5、L精氨酸乙酯为底物，用紫外吸收法进行测定的原理是：N苯甲酰L精氨酸乙酯英文缩写为BAEE）在波长253nm下的紫外吸收远远弱于苯甲酰L精氨酸（英文缩写为BA）。在胰蛋白酶的催化下，随着酯键的水解，苯甲酰L精氨酸逐渐增多，反应体系的紫外吸收宜随之相应增加。操作方法操作方法 取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯，分别加入25予热过的2.8ml底物溶液。向一只比色杯中加入0.2ml 0.001mol/L HCl，作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一比色杯中加入0.2ml待测酶液，立即混匀并记时，每半分钟读数一次，共读34分钟。绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率（即初速度）A253/min。样品胰蛋白酶样品胰蛋白酶BAEEBAEE活性单位活性单位每分钟每分钟A253nmA253nm增加值增加值0.001