第五章第三节——五电泳分离.ppt

《第五章第三节——五电泳分离.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第五章第三节——五电泳分离.ppt（47页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、Electrophoresis Theory,Methods and Electrophoresis Theory,Methods and AplicationsAplications五、电泳技术五、电泳技术电泳的概念电泳的概念 电泳是指带电颗粒在电场作用下电泳是指带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷相向着与其电荷相反的电极移动的现象。反的电极移动的现象。v 分辨率高，可以对混合物进行电泳分析，甚至结晶分辨率高，可以对混合物进行电泳分析，甚至结晶纯化的样品也可在电泳分析中分出两条带或更多的电纯化的样品也可在电泳分析中分出两条带或更多的电泳带。泳带。v 方法温和，对不稳定的生物大分子的分离纯化有时

2、方法温和，对不稳定的生物大分子的分离纯化有时比其它分离技术如沉淀法、离心、层析等更为方便、比其它分离技术如沉淀法、离心、层析等更为方便、可靠，甚至可作为具有一定规模的制备方法。可靠，甚至可作为具有一定规模的制备方法。电泳的特点电泳的特点一、基本原理一、基本原理当带电粒子当带电粒子以速度以速度 在电在电场中移动时，受场中移动时，受到大小相等、方到大小相等、方向相反的电场推向相反的电场推动力和平动摩擦动力和平动摩擦阻力的作用。阻力的作用。（一）基本原理（一）基本原理电泳阻滞力电泳阻滞力 电场强度电场强度 物质离子在电场中物质离子在电场中差速迁移差速迁移是电泳分离的基础。是电泳分离的基础。（二）影响

3、电泳速度的相关因素（二）影响电泳速度的相关因素1.颗粒性质颗粒性质：带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗：带电颗粒在电场中泳动的速度与带电颗粒的粒的净电荷量成正比净电荷量成正比，与，与颗粒的半径成反比颗粒的半径成反比。2.电场强度电场强度：E 愈高愈高，带电颗粒的泳动，带电颗粒的泳动速度愈快速度愈快。3.溶液性质溶液性质：pH 偏离分子的等电点愈远，解离度愈偏离分子的等电点愈远，解离度愈大，净电荷愈多，泳动速度越快；大，净电荷愈多，泳动速度越快；离子强度离子强度在在0.020.2为宜为宜;泳动速度与泳动速度与溶液黏度溶液黏度成反比。成反比。-SO4-SO4-SO4-SO4COO-Na+Na+吸附

4、的反离子吸附的反离子固定基团4.4.电渗电渗是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性是支持物本身所带的电荷吸附溶液中性质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈质相反的离子，在电场中移动的结果。其带电愈高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗高，电渗力愈大。当颗粒的泳动方向与电渗方向方向一致一致时，时，加快颗粒的泳动速度加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方；当颗粒的泳动方向与电渗向与电渗方向相反方向相反时，则时，则降低颗粒的泳动速度降低颗粒的泳动速度。5.5.焦耳热焦耳热 电泳过程中释放的热量与电流强度电泳过程中释放的热量与电流强度的平方成正比。当的平方成正比。当电场强度或电极缓冲液离电场强度或电极缓冲

5、液离子强度增高子强度增高，电流强度也增加，不仅，电流强度也增加，不仅降低分降低分辨率辨率，严重时甚至烧断或熔化支持介质。，严重时甚至烧断或熔化支持介质。6.6.筛孔筛孔在在筛孔大筛孔大的凝胶中溶质颗粒的的凝胶中溶质颗粒的泳泳动速度快动速度快。二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide gel electrophoresis（PAGE）v以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳方法。由于其分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物，分辨率高，不仅能分离含有各种大分子的混合物，而且可以研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、而且可以

6、研究生物大分子的特性，如电荷、分子量、等电点及分子构型。等电点及分子构型。v聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点：孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。孔径大小可调节，可用于分离多种生物分子。机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。机械强度好、弹性大，电渗低、分辨率高。电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分电泳分离后仍然保持生物活性，可用于生物大分子的制备。子的制备。1.聚丙烯酰胺凝胶的合成聚丙烯酰胺凝胶的合成丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-甲基双丙烯酰胺甲基双丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶催化剂催化剂聚合反应聚合反应凝胶凝胶丙烯酰胺和双丙烯酰胺量的确定丙烯酰胺和双丙烯酰

7、胺量的确定烯溶液烯溶液浓溶液浓溶液交联剂交联剂结点结点TEM(投射电镜投射电镜)image of a polyacrylamide(聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺)2.2.聚丙烯酰胺的聚合及影响因素聚丙烯酰胺的聚合及影响因素（1）化学聚合：）化学聚合：以过硫酸铵（以过硫酸铵（AP）为）为催化剂催化剂，以四，以四甲基乙二胺（甲基乙二胺（TEMED）为）为加速剂加速剂，使丙烯酰胺、甲，使丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺发生连锁反应，形成网状的聚合物。基双丙烯酰胺发生连锁反应，形成网状的聚合物。vpH：在：在碱性碱性 pH 时，反应速率时，反应速率高高；而在；而在酸性酸性条件时，条件时，同样浓度溶液，聚合速率同样浓度

8、溶液，聚合速率减慢减慢。v温度：在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重温度：在低温时聚合，凝胶会变得脆而浑浊，且重复性差，在复性差，在25 聚合的凝胶则较透明和有弹性。聚合的凝胶则较透明和有弹性。vO2：O2使过硫酸铵（使过硫酸铵（AP）分解。）分解。（2 2）光聚合：）光聚合：以核黄素为催化剂在少量的氧存在下以核黄素为催化剂在少量的氧存在下,分解成无色的还原型，在少量的分解成无色的还原型，在少量的O O2 2条件下，还原型条件下，还原型的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。的核黄素氧化成有游离基的黄素环，聚合反应发生。核黄素核黄素B1 B1 还原型还原型 游离基游离基 聚合反应聚合反

9、应光照光照O2v 优点：用量少。优点：用量少。聚合的时间可以自由控制。聚合的时间可以自由控制。v 缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好。缺点：光照的量不容易掌握，重现性不太好。光聚合适合于大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合于各种凝光聚合适合于大孔径凝胶的聚合，化学聚合适合于各种凝胶的聚合。胶的聚合。+蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离因素蛋白质的电荷量起主要作用蛋白质的电荷量起主要作用蛋白质的分子大小起主要作用蛋白质的分子大小起主要作用蛋白质分子的构型起主要作用蛋白质分子的构型起主要作用三三.不连续凝胶电泳的分离原理不连续凝胶电泳的分离原理系统的不连

10、续性表现在以下几个方面：系统的不连续性表现在以下几个方面：v凝胶系统的不连续性：凝胶系统的不连续性：上层为大孔径的上层为大孔径的浓缩胶浓缩胶，下层为小孔径的下层为小孔径的分离胶分离胶。v缓冲液离子组成及缓冲液离子组成及pH的不连续性：的不连续性：电极缓冲电极缓冲液为液为pH8.3的的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为缓冲液，而分离胶为pH8.9的的Tris-HCl缓冲液。缓冲液。（一）原理（一）原理在这样一个不连续的系统里，存在三种在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的物理效应，即样品的浓缩效应浓缩效应，凝胶的，

11、凝胶的分子分子筛效应筛效应和和电荷效应电荷效应，由于这三种物理效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。使样品分离效果好，分辨率高。v电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性mmClCl-a-aClCl-mm蛋蛋蛋蛋-a-a蛋蛋蛋蛋-mmGlyGly-a-aGlyGly-1.1.浓缩效应浓缩效应ClCl-：快离子；：快离子；GlyGly-：慢离子：慢离子vv 电泳进行时，在快离子后面形成一离子浓度低电泳进行时，在快离子后面形成一离子浓度低电泳进行时，在快离子后面形成一离子浓度低电泳进行时，在快离子后面形成一离子浓度低的区域，该区域为的区域，该区域为的区域，该区域为的区域，该区域为低电导

12、区低电导区低电导区低电导区。vv 电导强度与电导成反比，因此，在低电导区产电导强度与电导成反比，因此，在低电导区产电导强度与电导成反比，因此，在低电导区产电导强度与电导成反比，因此，在低电导区产生较高的电场强度。在快离子和慢离子之间形成一生较高的电场强度。在快离子和慢离子之间形成一生较高的电场强度。在快离子和慢离子之间形成一生较高的电场强度。在快离子和慢离子之间形成一个迅速移动的界面。个迅速移动的界面。个迅速移动的界面。个迅速移动的界面。vv样品蛋白质聚集在这个移动界面的附近，浓缩为样品蛋白质聚集在这个移动界面的附近，浓缩为样品蛋白质聚集在这个移动界面的附近，浓缩为样品蛋白质聚集在这个移动界面

13、的附近，浓缩为一个狭窄的中间层（浓缩一个狭窄的中间层（浓缩一个狭窄的中间层（浓缩一个狭窄的中间层（浓缩300300多倍）。多倍）。多倍）。多倍）。2.2.分子筛效应分子筛效应移动界面到达浓缩胶和移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的分离胶界面时，凝胶的pHpH变变化明显，缓冲液中甘氨酸的化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，迁移率超过解离迅速增加，迁移率超过蛋白质分子，随之高电场强蛋白质分子，随之高电场强度消失。当蛋白质分子量和度消失。当蛋白质分子量和构型不同时，通过分离胶所构型不同时，通过分离胶所受到的阻滞程度不同，导致受到的阻滞程度不同，导致泳动率不同，结果依据分子泳动率不同，结果依据分

14、子量的大小而分开。量的大小而分开。3.3.电荷效应电荷效应蛋白质所带电荷不同，泳动率也不同，故蛋白质所带电荷不同，泳动率也不同，故在同一电场强度中，单位时间内各分子迁移的在同一电场强度中，单位时间内各分子迁移的距离存在差异。因此，蛋白质样品经分离胶电距离存在差异。因此，蛋白质样品经分离胶电泳后，若样品组分的分子量相同，则它们将按泳后，若样品组分的分子量相同，则它们将按电荷顺序排列，从而导致分离。电荷顺序排列，从而导致分离。（二（二)操作操作垂直柱状、板状的不连续凝胶电泳系统垂直柱状、板状的不连续凝胶电泳系统组成和配制组成和配制样品的准备样品的准备加样加样电泳电泳检测检测1.1.不连续凝胶电泳系

15、统的组成和配制不连续凝胶电泳系统的组成和配制（1）缓冲液系统）缓冲液系统浓缩凝胶缓冲液浓缩凝胶缓冲液0.5mol/L Tris-HCl,pH6.7分离凝胶缓冲液分离凝胶缓冲液1.5mol/L Tris-HCl,pH8.9电极缓冲液系统电极缓冲液系统 0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷）（三羟甲基氨基甲烷）0.2mol/Gly (甘氨酸甘氨酸)pH8.3样品缓冲液样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl，pH 6.7,40%甘油、甘油、0.05mg/ml溴酚溴酚蓝蓝PH 8.3PH 6.7PH 8.9PH 8.3（2）不连续电泳浓缩胶和分离胶的配方）不连续电泳浓缩胶和分离胶的

16、配方贮存液贮存液 凝胶终浓度凝胶终浓度T 4%7.5%10%15%20%单体贮液（单体贮液（14.55:0.55）0.65 3.8 5.0 7.5 10浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液(ml)0.1 0 0 0 0分离胶缓冲液分离胶缓冲液(ml)0 0.3 0.3 0.3 0.3dd H2O(ml)4.25 10.9 9.7 7.2 4.7真空抽气真空抽气10%AP(过硫酸铵过硫酸铵)(ul)5 15 15 15 15TEMED四甲基乙二胺四甲基乙二胺(ul)2.5 7 7 7 7总体积总体积 5ml 15ml2.2.样品的准备样品的准备v 样品缓冲液与浓缩胶缓冲液样品缓冲液与浓缩胶缓冲液pHpH相同

17、。相同。v 样品缓冲液中可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶样品缓冲液中可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。v 样品缓冲液中通常加入溴酚蓝染料，用于控制电样品缓冲液中通常加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。泳过程。v 标准蛋白质样品：是一组（标准蛋白质样品：是一组（5 57 7种）已知分子量种）已知分子量范围的、构型相近的一套蛋白质，溶解在样品缓冲范围的、构型相近的一套蛋白质，溶解在样品缓冲液中备用。液中备用。3.3.加样要求加样要求v加样量一般加样量一般1020l。v用微量注射器距槽底三分之一处进样。注射器不用微量

18、注射器距槽底三分之一处进样。注射器不可过低可过低,以防刺破胶体以防刺破胶体,也不可过高也不可过高,以免样品下沉时以免样品下沉时会发生扩散。会发生扩散。v为避免边缘效应为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样。最好选用中部的孔注样。v 浓缩胶制备完毕，不宜储存，应立即电浓缩胶制备完毕，不宜储存，应立即电泳。泳。v 对垂直板凝胶，电泳槽中加入缓冲液，对垂直板凝胶，电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当样品进入分离胶后改为，当样品进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。时，停止电泳。4.4.电泳电泳

19、荧光探针荧光探针 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 氨氨 基基 黑黑 染色染色 银银 染染 色色 过碘酸过碘酸-Schiff-Schiff试剂试剂 阿尔辛蓝阿尔辛蓝 5.5.检测检测三、三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）在蛋白质样品和凝胶中加入在蛋白质样品和凝胶中加入SDS和还原剂和还原剂后，分子被解聚成多肽链，它们与后，分子被解聚成多肽链，它们与SDS充分结充分结合形成带负电荷的合形成带负电荷的SDS蛋白质复合物，所带蛋白质复合物，所带的电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，消除的电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子原有的电荷差异。电泳的迁移率不了不同分子原有的电

20、荷差异。电泳的迁移率不再受电荷的影响，而只与蛋白质或亚基的分子再受电荷的影响，而只与蛋白质或亚基的分子量大小有关。量大小有关。（一）基本原理（一）基本原理lgM=a-bRf 影响影响SDS-SDS-蛋白质结合的因素蛋白质结合的因素1.溶液中溶液中SDS的浓度的浓度2.样品缓冲液的样品缓冲液的pH、离子强度、离子强度3.二硫键是否完全被还原二硫键是否完全被还原（二）、操作（二）、操作凝胶浓度根据待测样品分子量大小决定，凝胶浓度根据待测样品分子量大小决定，凝胶用含凝胶用含0.1%SDS的的0.1M磷酸缓冲液配制，磷酸缓冲液配制，ACR：Bis=29：1。1 1、凝胶浓度的选择、凝胶浓度的选择2 2

21、、样品制备、样品制备样品溶于含样品溶于含样品溶于含样品溶于含1%SDS1%SDS、0.1%0.1%巯基乙醇的巯基乙醇的巯基乙醇的巯基乙醇的0.01M磷酸缓冲液中。上样前置磷酸缓冲液中。上样前置100oC水浴中密闭水浴中密闭煮煮2-5min。3 3、电泳条件、电泳条件电极液为含电极液为含电极液为含电极液为含0.1%SDS0.1%SDS的的的的0.1M磷酸缓冲液。磷酸缓冲液。4 4、固定与染色、固定与染色Tissue preparation 源组织源组织 微量离微量离心管心管 溴酚蓝溴酚蓝 旋涡旋涡Preparing acrylamide gels 浓缩胶浓缩胶浓缩胶浓缩胶/分离胶配置分离胶配置分

22、离胶配置分离胶配置Preparing acrylamide gels 异丙醇（水）异丙醇（水）Electrophoresis 电泳缓电泳缓冲液冲液 Electrophoresis 染色染色银染法银染法银染法银染法考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法Gel Blue Coomassie Coomassie solutionCoomassie solution考马斯亮蓝溶液考马斯亮蓝溶液 SDSSDS凝胶电泳扫描与染色图谱凝胶电泳扫描与染色图谱 M S SM S SS1 M S1 M S2 S2S1 M S1 M S2 S2（三）蛋白质分子的电泳迁移率与分（三）蛋白质分

23、子的电泳迁移率与分子量的计算子量的计算蛋白质分子量的计算蛋白质分子量的计算1.1.要求有一组标准蛋白质，其分子量应包含欲要求有一组标准蛋白质，其分子量应包含欲测分子的大小。测分子的大小。2.2.欲测分子的性质、构形与标准分子类似。欲测分子的性质、构形与标准分子类似。3.3.标准蛋白与被测分子在同一块凝胶上电泳。标准蛋白与被测分子在同一块凝胶上电泳。4.4.以标准样品的迁移率作横坐标，相应分子量以标准样品的迁移率作横坐标，相应分子量的对数作纵坐标，绘制标准曲线。的对数作纵坐标，绘制标准曲线。lgM=a-bRf Rf=蛋白质迁移距离蛋白质迁移距离溴酚蓝迁移距离溴酚蓝迁移距离Migration of proteins in SDS gels of varying acrylamide concentrations(%T).9 9 9 9个蛋白质：分子量个蛋白质：分子量个蛋白质：分子量个蛋白质：分子量94 kDa 94 kDa 14.4 kDa14.4 kDa