经典液相色谱法.ppt

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1、经典液相色谱法经典液相色谱法1.概述概述2.液液-固吸附柱色谱法固吸附柱色谱法3.平面色谱参数平面色谱参数4.薄层色谱法薄层色谱法5.纸纸色色谱谱法法以液体为流动相的色谱称为液相色谱法。根据操作形式的不同液相色谱法可以分为柱色谱法(columnchromatography)和平面色谱法(planarchromatography)。色谱过程在固定相构成的平面内进行的色谱法称为平面色谱法。平面色谱法主要有薄层色谱法（TLC）和纸色谱法。一、概述u优点：仪器设备简单，费用低；对样品预处理要求不高；可同时分析多个样品。u缺点：固定相颗粒较大且不均匀；常压下输送流动相；离线检测、分析周期长。u应用：产品

2、纯度控制、杂质检查、天然药物有效成分分离、中药定性鉴别等。吸附色吸附色谱谱：以一些多孔性物质，表面布满吸附位点(吸附中心)的固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等；流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂。吸吸附附:溶质在液固、气固两相交界面上集中浓缩的现象。它发生在固体表面上。二二.液液固固 吸附柱色吸附柱色谱谱液液固固 吸附柱色吸附柱色谱谱：将固体吸附剂装入管状柱内，用液体流动相进行洗脱的色谱法。吸附色谱示意图吸附色谱示意图吸附过程是样品中溶质分子和溶剂分子争夺吸附剂表面活性中心的过程。1.1.色谱分离过程：色谱分离过程：X:样品中各组分分子 Y:流动相分子Xm:流动相中溶质 Ya:吸附剂表

3、面的流动相分子Xa:吸附剂吸附的溶质分子 Ym:流动相由Ya回到流动相中 吸附平衡常数吸附平衡常数:流动相大量的,视为常数。Ka=Xa/Xm 吸附常数吸附常数组分Ka越大,tR越长。(组分易被吸附,移行速度慢,保留值就大)。2.2.吸附等温线吸附等温线 一定温度下,某组分在吸附剂表面达到吸附平衡时,该组分在两相中的浓度相关曲线。等温线色谱峰原因直线型(a)对称吸附剂表面没被饱和凸型 (b)拖尾吸附剂表面具有吸附能力不同的吸附位点凹型 (c)前沿进样量较大3.吸附吸附剂剂的的选择选择和吸附活度：和吸附活度：对吸附剂的要求：（1）表面积大，具有一定吸附能力（2）不与流动相发生化学反应（3）粒度要细

4、，200目左右3.1 氧化铝氧化铝 常用吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等酸性(pH45)分离酸性物质，如氨基酸中性(pH7.5)分离生物碱，挥发油碱性(pH910)分离碱性物质，如生物碱3.2 硅胶硅胶自由型自由型束缚型束缚型活泼型活泼型 吸附能力稍弱于氧化铝,用于分离弱酸和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。硅醇基是使硅胶有一定吸附能力的活性基团。结结构：构：内部硅氧交联结构多孔结构表面有硅醇基氢键作用吸附活性中心3.3 聚聚酰酰胺胺由酰胺聚合而成的高分子物质。l 吸附原理：利用分子内酰胺基和羰基,可与酚、酸、硝基化合物等形成氢键。l 吸附力与能形成氢键的基团有关，对位间位取代基均能形成氢键的

5、,吸附力增大。l邻位基团间能形成分子内氢键的,吸附力减小。l 芳香核具有较多共轭键时,吸附力增大。3.4.吸附吸附剂剂的活度的活度氧化铝，硅胶的吸附力大小与其含水量有较大关系。活性级越大，含水量越多，吸附能力越小，活性越小活性级越大，含水量越多，吸附能力越小，活性越小活性 活性级活化：活化：105110加加热热除水除水为为活化。活化。脱活：加一定水份，降低活性。4.4.流流流流动动动动相的相的相的相的选择选择选择选择：流动相又称洗脱剂、展开剂或移动相。要求:1.纯度高 2.稳定(对样品和吸附剂不反应)3.对样品溶解度大 4.粘度小(易洗脱)。选择流动相应考虑三方面：被测组分被测组分、吸附剂吸附

6、剂和和流动相流动相的性质的性质极性极性流动相的洗脱实质流动相的洗脱实质：流动相分子与被分离分子竞占吸附剂表面活性中心的过程。4.1.被被测组测组分性分性质质（极性大小）：（极性大小）：判断物判断物质质极性大小的极性大小的规规律：律：基本母核相同，分子中基团的极性越强，分子的极性越强；基本母核相同，分子中极性基团数目越多，分子极性越大；分子双键多，吸附力，共轭度，吸附性。空间排列,影响极性。形成氢键，极性小形成氢键，极性小常常见见化合物极性：化合物极性：烷烃烯烃醚类硝基化合物二甲胺脂类酮类醛类硫醇胺类酰胺醇类酚类羧酸类4.2.吸附吸附剂剂的活度的活度吸附剂的活性大，对被测组分的吸附能力强。强强极

7、性物极性物质质选择选择吸附能力弱的吸附吸附能力弱的吸附剂剂 弱极性物弱极性物质质选择选择吸附能力吸附能力强强的吸附的吸附剂剂4.3.流动相的极性：流动相的极性：相似相溶原则相似相溶原则“相相似似相相溶溶”原原则则：根据组分性质、吸附剂的活性，选择适当极性的流动相常用的流动相极性递增的次序是：常用的流动相极性递增的次序是：u石油醚环已烷四氯化碳苯甲苯乙醚氯仿醋酸乙酯正丁醇丙酮乙醇甲醇水。被分离物质的极性吸附剂活度 流动相极性 大小大小大小4.4.三者关系图示三者关系图示：组分 吸附剂 流动相 极性 活性小 极性 非(弱)极性 活性大 非极性或弱极性三三.平面色谱主要技术参数平面色谱主要技术参数1

8、.定性参数定性参数:(1)比移值比移值(retardation factor,Rf)RfA=l1/l0RfB=l2/l0一般一般:0Rf 1Rf 可用范围：0.2-0.8Rf 最佳范围：0.3-0.5Rf是平面色谱的定性参数,在同一色谱条件下,同样结构的分子有相同的Rf值。Rf与分配系数和保留因子的关系与分配系数和保留因子的关系在色谱条件确定的情况下，在色谱条件确定的情况下，K大大Rf 小，小，K小小Rf 大。大。Vm:薄层板的死体积;VS:板固定相体积;K:该条件的分配系数分离物分离物质质性性质质 薄薄层层板性板性质质 展开展开剂剂极性极性温度温度展开展开剂剂蒸气蒸气饱饱和程度和程度 Rf

9、影响因素影响因素(2)相相对对比移比移值值(retardation factor,Rr)某物质，当色谱条件一致时，Rf定值，定性用，但重现性差。可用相对比移值定性。特点：特点：u消除系统误差uRr可以小于1，也可大于1参考斑可以是另加的物质，亦可以样品中另一组分为参考。d两色斑中心间的距离。W1、W2两色斑的峰宽(扫描测定)。一般亦可用纵向直径。2.分离参数分离参数分离度(resolution;R)例：在薄层板上分离A、B两组分的混合物，当原点至溶剂前沿距离为16.0 cm 时，两斑点质量重心至原点的距离分别为6.9 cm 和5.6 cm，斑点直径分别为0.83 cm 和0.57 cm。求两组

10、分的分离度及Rf 值。解：四四.薄层色谱法薄层色谱法点样点样展开展开过程：铺板过程：铺板活化活化点样点样饱和饱和展开展开显色显色定性定量定性定量1.原理原理:将混合组分的试液,点在铺了吸附剂的玻璃板一端,在密闭容器中用适当的溶剂(展开剂、流动相)展开,各组分不断地被吸附,解吸附随展开剂前移,利用吸附剂对不同组分的吸附力(吸附常数)不同,产生差速迁移,而达到分离。uTLC特点：快速；灵敏(几几十微克)；高选择；显色方便。2.固定相固定相(stationaryphase)吸附柱色谱的固定相薄层色谱也可以使用,但薄层色谱所用的硅胶、Al2O3粒度比柱色谱更细。硅胶40m(一般要求200目左右)符号符

11、号:硅胶G硅胶+煅石膏硅胶H硅胶(未加任何物质)硅胶HF254硅胶不含粘合剂+荧光物质硅胶GF254硅胶+煅石膏+荧光物质吸附剂(硅胶),粘合剂(煅石膏),掺入荧光剂254nm,呈黄绿色。u薄层板的铺制常用平滑的玻璃板，洗净待用。l软板软板:吸附剂直接铺涂。最大缺点，风吹即飞(已不用)。l硬板硬板:吸附剂+粘合剂糊状铺板凉干活化l常常用用粘粘合合剂剂:CMC-Na羧甲基纤维素钠。(0.250.75%的CMC-Na水溶液与吸附剂3:1调粘研磨)l活化活化:凉干的板在110活化1小时，于干燥器中备用。3.展开剂选择展开剂选择:(同柱同柱)仅操作方法不同。仅操作方法不同。分离强极性物质,选择强极性展

12、开剂,同时也应考虑固定相的活性。分离混合样品时,展开剂选择一般规则:(1)先用单一的中等极性展开剂试一下。(2)改用二元展开剂,其比例要摸索。目的目的:改变展开剂的极性。改变展开剂的极性。展开剂展开剂Rf（A）Rf（B）分离效果分离效果苯苯0.450.42分不开分不开苯苯+甲醇甲醇0.380.52分开分开例：例：A A，B B两组分的试样两组分的试样问：问：A、B哪个组分的极性大哪个组分的极性大答：答：B的极性大。展开剂极性增大，极性大的的极性大。展开剂极性增大，极性大的Rf 值增大。值增大。一般做实验组分Rf控制在0.20.8之间。4.点样与展开点样与展开:4.1.点样点样 u点样量一般在1

13、几十g,23mm。u点样量太大,斑易拖尾,影响分离效果。注注:有时用于薄层制备与分离提取时,条状点样。u点样位置:距底边1.52cm处,铅笔画线、点点。4.2 展开展开l先饱和1520min，防止边缘效应l展开剂浸薄层板下端0.5cm，不能浸住起始线l层析缸应密闭l展开方式：单向展开，双向展开5.定性和定量分析定性和定量分析5.1定位本身有色-显色剂紫外灯下显色 -日光下显色日光下显色 碘碘 硫酸硫酸 茚三酮等茚三酮等-荧光薄层板荧光薄层板 +荧光物质荧光物质-紫外吸收物紫外吸收物质质定定 位位-荧光薄层板荧光薄层板常用硅胶常用硅胶GFGF254254板板5.2定性分析：比较组分与对照品Rf值

14、对未知样品，要几个展开体系均有一致对未知样品，要几个展开体系均有一致R Rf f 值，或值，或双向展开法确认。双向展开法确认。5.3定量分析洗脱法洗脱法 薄层扫描薄层扫描 目视比色目视比色 比较色斑大比较色斑大小、深浅。小、深浅。误差误差10 刮下刮下 溶解溶解 光度法测定光度法测定 误差误差5%误差误差 b cRfa b cabc例例.在在硅硅胶胶粘粘合合薄薄层层板板上上，用用氯氯仿仿作作展展开开剂剂，对对某某极极性性物物质质进进行行分分离离，Rf值值几几乎乎为为0，若若欲欲得得合合适适的的Rf值值，则则要要改改变变展展开剂的极性，可选用下列哪种展开剂进行试验开剂的极性，可选用下列哪种展开剂

15、进行试验?()A氯仿和环己烷氯仿和环己烷 B氯仿和甲醇混和溶剂氯仿和甲醇混和溶剂 C环己烷环己烷 答案：答案：B偶氮苯偶氮苯对甲氧基偶氮苯对甲氧基偶氮苯苏丹黄苏丹黄苏丹红苏丹红对氨基偶氮苯对氨基偶氮苯对羟基偶氮苯对羟基偶氮苯例例.硅胶板、石油硅胶板、石油醚醚-苯（苯（4：1），），Rf 次序？次序？P 324 掌握液固吸附色谱法和纸色谱法的分离原理；掌握液固吸附色谱法和纸色谱法的分离原理；掌握平面色谱参数及其计算；掌握平面色谱参数及其计算；熟悉平面色谱法常用的固定相及其选择；熟悉平面色谱法常用的固定相及其选择；熟悉熟悉TLC的展开剂的选择及其操作方法；的展开剂的选择及其操作方法；了解经典液相色谱法的定性定量分析方法及其应用；了解经典液相色谱法的定性定量分析方法及其应用；四四.小小 结结