杨恪鉴超氧化物歧化酶(SOD)的生产.ppt

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1、项目四项目四:超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)的生产的生产任务一：任务一：SOD制备方案的制定制备方案的制定生药1121 第五组 2011423242杨恪鉴杨恪鉴一一.SOD的概况二.SOD的运用三.SOD的生产四.SOD的活力测定一.SOD的概况1.SOD的概念 超氧物歧化酶（Superoxide Dismutase简称SOD）是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。全球118位科学家发表联合声明：自由

2、基是百病之源，SOD是健康之本。体内的SOD活性越高，寿命就越长。2 2、SODSOD的分类3、作用原理基本原理SOD属于金属蛋白酶，按照结合金属离子种类不同，该酶有以下三种：含铜与锌超氧化物歧化酶（Cu-ZnSOD）、含锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和含铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。三种SOD都催化超氧化物阴离子自由基，将之歧化为过氧化氢与氧气。人体内的自由基人体内的自由基 在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体内的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能

3、力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代谢失常等，最终使机体发生病变。4 4.SOD的理化性质 3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性 3.2 SOD的吸收光谱特性 3.3 SOD稳定性及影响因素5.SOD的作用 它催化超氧阴离子转化为H2O2和O2的反应，即催化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反应，从而清除O2-，2O2-+2H+H2O2+O2，在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用，在免疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。6 6、测定、测定超氧化物歧化酶（SOD）的催化底物是O2，一般多以一定时间内产物生成量或底物的消耗量作为酶活性单

4、位。由于O2 自身很不稳定，且不易制备，测定SOD的方法除少数采用直接法外，一般多为间接法。常用的有：邻苯三酚自氧化法 细胞色素C还原法（McCord法）化学发光法 免疫学方法 电泳法3.1 SOD对氰化物和H2O2的敏感性长时间用过氧化氢处理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影响3.2 SOD的吸收光谱特性CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在280 nm处并没有最大吸收峰。CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在680 nm左右，这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。3.3 SOD稳定性及影响因素PH、热、蛋白酶的影响：SOD在pH

5、5.39.6间催化性能良好，在pH4.5pH11间能稳定存在。pH3.6时，CuZn-SOD中95%的Zn要脱落，在pH12.2时，SOD的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时,即使加热到95,其活性损失也很少其他因素：SOD活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还发现有机溶剂和Cl对SOD的活性具抑制作用二 SOD的运用1.药物SOD是一种新型的抗炎症药，根据SOD作用机制和毒性试验 ，它对治疗因O2-引起的各种 疾病都有一定的疗效。为此，SOD可作为抗衰老、抗炎症

6、、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品。此外，SOD对治疗贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也可望有效。二 SOD的运用2.添加剂 国外不少高级化妆品都添加SOD，国内也有数家工厂或公司在开发和生产SOD化妆品，如大宝SOD密，康妮SOD、SOD康舒达霜剂等。SOD作为化妆品添加剂主要有3个优点：（1）有明显的防晒效果（2）可防皮肤衰老，阻止紫褐质（老年斑）的形成（3）有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果。国外把SOD作为食品添加剂的例子是加在口香糖和饮料中。我国贵州农学院已开发出刺梨SOD饮料。SOD及修饰过的SOD还可作为外用药膏、眼药及牙膏

7、等的添加剂 二 SOD的运用3.生化试剂国外已有数家公司如Sigma公司等出售SOD试剂，国内也有厂家批量生产SOD试剂，如中科院上海生化所东风试剂厂、南京建成生物工程研究所等。此外，SOD有可能作为某些疾病的探针，如郭彦等人认为脑瘤组织线粒体Mn-SOD降低是转化细胞的可靠生化指标之一，并可作为评估脑瘤分化程度的参考。综上所述，随着人们对SOD更广泛深入的研究，不同类型SOD、SOD修饰物及人工有机合成SOD模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面发挥出更大的作用。三.SOD的生产 1.SOD酶的提取 称取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲

8、液（pH7.8）15ml，继续研磨20min,使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冰冻离心15min，放弃沉淀，取上清液。2.去除杂蛋白 上清液中加入0.25倍体积的氯仿乙醇混合液搅拌15min,6000r/min离心15min，放弃沉淀，得到的上清液即是粗酶液 3.SOD酶的沉淀分离 粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度60%，持续搅拌15min，6000r/min离心15min，得到SOD酶沉淀三.SOD的生产4.将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行

9、纯化，然后超滤浓缩。5.用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量6.将浓缩冷冻干燥后即得成品。四、超氧化物歧化酶（SOD）的测定原理连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-,生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30-45s后就与时间呈现性关系。中间产物在325nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时能催化生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。仪器紫外分光光度计、pH计,离心机试剂 0.05mol/L连苯三酚溶液：称取3.15g连苯三酚用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500ml pH=8.3 Tris-HCl缓冲溶液

10、0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液:NH2C(CH2OH)3 121.14取12.114g,溶解，定容至100ml0.1mol/L盐酸:取8.6(9)ml浓盐酸，稀释至1000ml5 0毫升0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液19.9_毫升0.1mol/L盐酸混匀并稀释至100毫升。(保存温度:常温密封避光保存)测定步骤酶液的制备称取6g样品，加于现在冰箱中放置的缓冲液60ml(样品的10倍，视情况定)，在冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min 离心20min,取上清液用于酶活测定。连苯三酚自氧化速率的测定取4.5ml缓冲液，在25水浴中保温15mi

11、n,加入10 连苯三酚液，迅速摇匀空白：取4.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入10 缓冲液，迅速摇匀倒入光径1cm的比色杯中，在325nm波长下于恒温池中每隔30s测A值一次计算线形范围内，每1minA的增值，此即连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min酶活测定测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同，取1.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入3ml酶液，加入10 连苯三酚液，迅速摇匀空白：取1.5ml缓冲液，在25水浴中保温15min,加入3ml酶液，加入10 缓冲液，迅速摇匀计算加酶后连苯三酚自氧化速率结果计算样品酶活单位表示，SOD酶活单位（U）/g鲜重样品酶活单位=式中酶样品在325nm处每分钟光密度变化值 V反应液体积 n酶液稀释倍数（若酶液足够多，可不稀释即n为1）五.SOD使用及生产时的注意事项1.SOD的安全性大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然SOD是Mr在30 000以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，其原因也正在进一步研究中。2.SOD生产时的注意事项 2.1 在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底 2.2 PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等 2.3 要学会正确使用分光光度计谢谢！谢谢！