08核移植技术与动物克隆-HXY.ppt

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1、核移植技术与动物克隆核移植技术与动物克隆1一、什么是动物克隆？一、什么是动物克隆？动物克隆是一种通过动物克隆是一种通过核移植核移植过程进行过程进行无性繁殖无性繁殖的技术。的技术。过程：发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，过程：发育早期的动物胚胎细胞，或成年动物的体细胞，经显微手术移植到经显微手术移植到去掉细胞核的卵母细胞去掉细胞核的卵母细胞中之后，在适当中之后，在适当的条件下，可以重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到的条件下，可以重新发育成正常胚胎。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。特点：经过核移植而产生

2、的动物，其遗传结构与细胞核供特点：经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。体完全相同。这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植这种不经过有性生殖过程，而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术，就叫做动物克隆。动物克隆。2精卵结合胚 胎细 胞个 体3核移植技核移植技术：利用利用显微操作技微操作技术将一个将一个细胞的胞的细胞移胞移植到另一个植到另一个细胞中，或者将两个胞中，或者将两个细胞的胞的细胞核（或胞核（或细胞胞质）进行交行交换，从而可能，从而可能创造无性造无性杂交生物新品种的一交生物新品种的一项技技术。4胚胚胎胎

3、克克隆：隆：使用的核供体使用的核供体细胞如果来自多胞如果来自多细胞胞阶段的胚胎。段的胚胎。体体细胞克隆：胞克隆：使用的核供体使用的核供体细胞来自胞来自动物体物体的体的体细胞。胞。核移植技核移植技术的分的分类：5胚胎克隆的操作胚胎克隆的操作过程：程：6显微操作微操作仪78910111.两栖类细胞核移植1938年年Spemann最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植最先提出将多细胞胚胎的每一个细胞核移植到去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。到去掉核的卵母细胞中，使它们重新发育成胚胎的设想。1952年，年，Briggs和和King沿用沿用Spemann的思路和实验技术，首的思路和实验技术

4、，首次获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代次获得两栖动物美洲豹蛙胚胎细胞核移植的后代核供体为囊胚期的胚胎细胞实验成功核供体为原肠胚期的中胚层和内胚层细胞实验失败证明早期胚胎核具有发育的全能型12n1970年年JohnGurdon以青蛙脚蹼以青蛙脚蹼角角质化化细胞胞进行移核行移核试验，蛙卵，蛙卵发育成了蝌蚪。育成了蝌蚪。证明两栖明两栖类分化的体分化的体细胞核也具有胞核也具有发育全能性。育全能性。132.鱼类的核移植从1961年开始，童第周等以金鱼和鳑鮍鱼为材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异，以及细胞质对细胞核的影响14 1979年，

5、中国科学院武汉水生物研究所利用鲫鱼做移核试验。他们把鲫鱼囊胚期细胞经过385天59代连续传代培养后，再将此种培养细胞的细胞核移植到同种鲫鱼的未受精卵中。到1980年4月，他们成功地培育了两尾无性繁殖的幼鱼，其中一条发育正常。15 1989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。163.哺乳类的细胞核移植 1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。17u将卵细胞受精，在精、卵核融合之前，把精核去掉，然后放入加有适量细胞松驰B的溶液中。u经此番处理的卵细胞的染色体复制后出

6、现了两个核，将此双核细胞放入正常培养液中培养。u卵中的双核细胞自动融合，并且细胞开始分裂。u将此种胚胎移入母鼠子宫培育。u生产出7只单亲小鼠。18 1981年，瑞士日内瓦大学和美国杰克逊实验室合作，首次对小鼠卵进行移核试验获得成功。他们将囊胚内细胞团细胞囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将此胚胎移入同步孕鼠子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。19二二、核移植技、核移植技术的一般操作程序的一般操作程序 核移植克隆哺乳动物的技术操作过程主要包括核受体和核供体的处理和制备、核移植、重组胚的体外或体内培养、核移植胚胎移入代孕母畜（寄母）等步骤。211

7、1核受体核受体细胞的准胞的准备受体细胞的种类：受体细胞的种类：卵母细胞卵母细胞、受精卵受精卵、2-2-细胞胚胎细胞胚胎。其中其中卵母细胞最为普遍卵母细胞最为普遍。这是因为在卵母细胞的细胞质含有这是因为在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列，生重新排列，使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。同受精卵一样开始个体发育过程。卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，

8、从输卵管冲出体内成熟的理，从输卵管冲出体内成熟的MM卵母细胞。二是从屠宰场卵母细胞。二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘卵母细胞复合体，在体外培卵母细胞复合体，在体外培养成熟后作为受体。养成熟后作为受体。22如何给受体细胞去核？如何给受体细胞去核？显微操作显微操作细胞松弛素结合高速离心细胞松弛素结合高速离心紫外照射紫外照射232核供体核供体细胞的准胞的准备细细胞核供体胞核供体胞核供体胞核供体细细胞首先必胞首先必胞首先必胞首先必须须是是是是完整的二倍体完整的二倍体完整的二倍体完整的二倍体，该细该细胞必胞必胞必胞必须须保保保保持有供体持有供体持有供体持有供体动动物完整的

9、基因物完整的基因物完整的基因物完整的基因组组；其次，供体其次，供体其次，供体其次，供体细细胞核必胞核必胞核必胞核必须须能能能能够够在受体在受体在受体在受体细细胞胞胞胞质质的作用下，的作用下，的作用下，的作用下，产产生生生生细细胞分化胞分化胞分化胞分化过过程的倒程的倒程的倒程的倒转转，变变得如同得如同得如同得如同刚刚刚刚受精的合子一受精的合子一受精的合子一受精的合子一样样，能重，能重，能重，能重新完成从受精到新完成从受精到新完成从受精到新完成从受精到发发育成一个正常育成一个正常育成一个正常育成一个正常动动物个体的全物个体的全物个体的全物个体的全过过程。程。程。程。供体供体供体供体细细胞主要有两大

10、胞主要有两大胞主要有两大胞主要有两大类类：胚胎卵裂球和体：胚胎卵裂球和体：胚胎卵裂球和体：胚胎卵裂球和体细细胞。另外，胞。另外，胞。另外，胞。另外，核供体核供体核供体核供体细细胞的来源胞的来源胞的来源胞的来源还还有胚胎干有胚胎干有胚胎干有胚胎干细细胞和胎儿成胞和胎儿成胞和胎儿成胞和胎儿成纤维细纤维细胞。胞。胞。胞。24如何获取供体细胞核？如何获取供体细胞核？显微操作显微操作细胞松弛素结合高速离心细胞松弛素结合高速离心核体核体胞胞质体体253 3细胞核移植胞核移植 常用的核移植方法有两种，即常用的核移植方法有两种，即常用的核移植方法有两种，即常用的核移植方法有两种，即胞质内注射胞质内注射胞质内注

11、射胞质内注射和和和和透明带下注射透明带下注射透明带下注射透明带下注射。胞质内注射是用一个外径胞质内注射是用一个外径胞质内注射是用一个外径胞质内注射是用一个外径5 5 5 58m 8m 8m 8m 的的的的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细注核针吸取供体核后直接注射进卵母细注核针吸取供体核后直接注射进卵母细注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法。胞胞质内的方法。胞胞质内的方法。胞胞质内的方法。透明带下注射则是把供体细胞核注射透明带下注射则是把供体细胞核注射透明带下注射则是把供体细胞核注射透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，

12、在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合。核移植后用电刺激进行细胞融合。核移植后用电刺激进行细胞融合。核移植后用电刺激进行细胞融合。http:/ 经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外经融合和激活的重组胚移入中间受体作体内或体外培养，观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体培养，观察重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚常采用体内培养方法获得内培养方法获得桑椹胚和囊胚桑椹胚和囊胚，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋，即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养后移入休情期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d4-7

13、d，发育至桑，发育至桑椹胚和囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内椹胚和囊胚。猪的核移植重组胚移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养作体内培养7d7d，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作，发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移植胚多作体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。体外培养，发育至桑椹胚或囊胚。286 6胚胎移植胚胎移植 重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择重组克隆胚胎移植的受体母畜要选择皮毛颜色与供体品种皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，、体格稍大的当地品种，进行同期发情处理，按常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。按

14、常规方法移植代孕母畜（寄母）的子宫中，待其发育到产仔。29Cell Engineering30Cell Engineering31Cell Engineering32 克隆羊与体细胞核移植克隆羊与体细胞核移植3334第一步第一步 取妊娠期的取妊娠期的6 6岁母绵羊（岁母绵羊（Finn DorsetFinn Dorset白品种白品种母羊）的乳腺细胞作核供体细胞，母羊）的乳腺细胞作核供体细胞，用饥饿法使其进用饥饿法使其进入休眠状态而使全部基因具有活性入休眠状态而使全部基因具有活性。35第二步第二步注射促性腺激素，促使母羊（注射促性腺激素，促使母羊（SottishBlackface黑面母黑面母绵羊）

15、排卵，羊）排卵，2833小小时取其未受精卵，快速取其未受精卵，快速去核，放入去核，放入10%FCS、1%FCS和和0.5%FCS连续5天，天，使其使其进入入G0期期做成受体做成受体细胞。胞。36第三步第三步乳腺乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中，在微胞与无核卵放入同一培养皿中，在微电流的作用下，将乳腺流的作用下，将乳腺细胞融入卵中，形成一个含有胞融入卵中，形成一个含有新的新的遗传物物质的卵的卵细胞。胞。37第四步第四步新的卵新的卵细胞植入羊的胞植入羊的结扎的扎的输卵管内，卵管内，6 6天天后后发育育为桑椹胚或囊胚（桑椹胚或囊胚（816816个个细胞）。胞）。38第五步第五步将此早期胚胎移入假孕母

16、羊子将此早期胚胎移入假孕母羊子宫中，中，产下多利下多利即即为6岁母羊的复制品，也母羊的复制品，也为白色。白色。39问题：问题：3个母亲克隆出多莉，个母亲克隆出多莉，3只公羊能克隆出一只只公羊能克隆出一只小公羊来吗？小公羊来吗？多莉多莉100是白面绵羊的复制品吗？是白面绵羊的复制品吗？40问题：问题：体细胞核移植时，体细胞核移植时，如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体处如何使处在细胞周期不同阶段上的核供体和受体处于同步状态？于同步状态？核全能性的恢复（重编程）？核全能性的恢复（重编程）？41血清血清“饥饿饥饿”法法42实验成功的关键：血清饥饿使使细胞核和去核卵胞核和去核卵细胞胞处于于细胞周

17、期中相匹胞周期中相匹配的配的阶段段使使结合在基因（合在基因（DNADNA）上的）上的调控蛋白脱落下来控蛋白脱落下来重新重新编程（程（reprogram,remodel ）4344实验结果424只成体绵羊细胞核移植277个融合细胞（63.8%）移入母羊输卵管成功247个（89.2%）发育到桑椹期的胚胎29枚(11.7%)植入13只母羊子宫后1头羊怀胎产出总成功率0.23%45克克隆隆动物物的的鉴定：定：DNA指指纹：指每个个体所特有：指每个个体所特有的基因多的基因多态性性鉴定方法：定方法：RAPD微微卫星星RFLPDOLLY的的鉴定：微定：微卫星星 46为何是突破性的工作：为何是突破性的工作：第

18、一，解决了使供体细胞与核受体细胞（去核卵细胞）同步的方法。第二，解决了用体细胞做核供体与转基因的问题。47克隆羊成果的重要生物学意义：克隆羊成果的重要生物学意义：第一，第一，证明了一个已明了一个已经完全分化了的完全分化了的动物体物体细胞仍然保持着当初胚胎胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部胞的全部遗传信息，并且信息，并且经此技此技术处理后，体理后，体细胞恢复了失去的全能性形成胞恢复了失去的全能性形成完整个体。完整个体。对于动物来说，随着分化的演进，细胞逐渐丧失其分化能力：全能性多能性单能性分化成熟的体细胞48第二，多利是世界上首例利用成年哺乳第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体物体细胞作胞作为供

19、体供体细胞繁殖的克隆羊，即成体胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。它的成功提示我母羊的复制品。它的成功提示我们可以可以进一步一步做到，在培育体做到，在培育体细胞成胞成为核供体之前，利用核供体之前，利用“基因靶基因靶”技技术精确地精确地诱发核基因的核基因的遗传改改变或或精确地植入目的基因，再用精确地植入目的基因，再用选择技技术准确地挑准确地挑选那些那些产生了令人生了令人满意意变化的化的细胞作胞作为核供体，核供体，从而生从而生产出基因克隆体。也就是出基因克隆体。也就是说，我，我们可以可以按照人的意志去改按照人的意志去改选、生、生产物种。物种。49第三，在第三，在现代生物学代生物学领域中，沿有任何一

20、域中，沿有任何一项研研究成果能究成果能够比通比通过对基因基因进行有行有规律地控制而解决律地控制而解决更多的更多的问题的先例。多利羊的的先例。多利羊的诞生及生生及生长表明，利表明，利用克隆技用克隆技术复制哺乳复制哺乳类动物的最后技物的最后技术障碍已被突障碍已被突破，在理破，在理论上已成上已成为可能。可能。50目前已经克隆出的动物三、三、核移植技核移植技术的的应用用1制制备转基因克隆基因克隆动物，物，进行生物行生物药物生物生产；2培育培育优良畜种，良畜种，扩大良种种群大良种种群；3开展异种开展异种动物克隆，拯救物克隆，拯救濒危危动物；物；4与干与干细胞技胞技术结合，开展治合，开展治疗性克隆性克隆5

21、利用核移植技利用核移植技术，研究生物学的基本，研究生物学的基本问题。52生殖性克隆生殖性克隆53治治疗性性克克隆隆细胞治疗组织替代器官移植54培培育育各各种种疾疾病病动物物模模型型应用核移植技术可以培育基因完全一致的实验动物模型，为遗传学，病理学研究提供良好的实验材料。动物种类动物种类动物种类动物种类 疾病模型数疾病模型数疾病模型数疾病模型数 猪猪猪猪 6565 猫猫猫猫 123123 狗狗狗狗 20320355四、克隆技术存在的问题 理论问题理论问题分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机

22、理还不清楚；基因关闭，细胞重新恢复全能性的过程）的机理还不清楚；克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。56实践问题实践问题克隆动物的成功率还很低克隆动物的成功率还很低 生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。即使是正常发育的即使是正常发育的“多莉多莉”，也被发现有早衰迹象，也被发现有早衰迹象 57除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤除了以上的理论和技术障碍外，克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。用。58CCTV关于克隆人的一个科普节目：http:/