血红蛋白的提取和分离.ppt

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1、血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离一、一、凝胶色谱法（分配色谱法）凝胶色谱法（分配色谱法）根据被分离物质的蛋白质相对分子根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，质量的大小，利用具有网状结构的利用具有网状结构的凝胶凝胶的分子筛作用，来进行分离。的分子筛作用，来进行分离。大多数凝胶是由大多数凝胶是由多糖类化合物多糖类化合物（如（如葡聚糖或琼脂糖）构成的葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。内部有许多贯穿的通道。.概念：概念：.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程.凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理分子筛效应：分子筛效应：当相对分

2、子量不同的蛋白质通过凝当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。分离。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质过程的

3、动画演示二、缓冲溶液二、缓冲溶液1.1.概念概念:在一定的范围内，凡是能够在一定的范围内，凡是能够抵制外加抵制外加少量强酸或强碱少量强酸或强碱的影响使原来溶液的影响使原来溶液pHpH值基本保持值基本保持不变的混合溶液。不变的混合溶液。2.2.缓冲溶液的组成举例：缓冲溶液的组成举例：H H2 2COCO3 3 NaHCO NaHCO3 3、CHCH3 3COOH COOH CH CH3 3COONaCOONaNaHNaH2 2POPO4 4 Na Na2 2HPOHPO4 4、KHKH2 2POPO4 4 K K2 2HPOHPO4 43.3.缓冲溶液的配制缓冲溶液的配制在电场的作用下，这些带电

4、分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。其所带电荷相反的电极移动。其所带电荷相反的电极移动。其所带电荷相反的电极移动。琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图琼脂糖凝胶电泳示意图.概念：概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。三、电泳：三、电泳：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳.电泳原理：电泳原理：电泳利用了待分离样品中各种电泳利用了待分离样品中各种分子带电性分子带电性质的差异质的差异以及以及分子本身的大小分子本身的

5、大小，形状的不同形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。品中各种分子的分离。.常见电泳类型：常见电泳类型：琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSSDS聚丙聚丙烯烯酰胺凝胶电泳酰胺凝胶电泳迁移率取决于它所带迁移率取决于它所带迁移率取决于它所带迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分净电荷的多少以及分净电荷的多少以及分净电荷的多少以及分子的大小、形状。子的大小、形状。子的大小、形状。子的大小、形状。电泳迁移率电泳迁移率电泳迁移率电泳迁移率完全取决于完全取决于完全取决于完全取决于分子的大小。分子的大小

6、。分子的大小。分子的大小。课外拓展：课外拓展：用用SDSSDS测定蛋白质分子量的方法测定蛋白质分子量的方法 使用使用SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测定测定蛋白质的分子量时，可蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子选用一组已知分子量的标准蛋白量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的子量的标准蛋白的电泳区带位置电泳区带位置，用，用电泳电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以，可以测定测定未知蛋白质未知蛋白质的分子量。的分子量。市场上有高分市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白子量、次高分子量及低分子量的标准

7、蛋白试剂出售。试剂出售。实践训练实践训练1.1.1.1.在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质在凝胶色谱法分离蛋白质中，所用凝胶的化学本质是是是是()()()()A.A.A.A.糖类化合物糖类化合物糖类化合物糖类化合物 B.B.B.B.脂质脂质脂质脂质 C.C.C.C.蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 D.D.D.D.核酸核酸核酸核酸2.SDS2.SDS2.SDS2.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动聚丙烯酰胺凝胶电泳中决定蛋白质或多肽移动聚丙烯酰胺凝胶电泳

8、中决定蛋白质或多肽移动速度的主要因素是速度的主要因素是速度的主要因素是速度的主要因素是()()()()A.A.A.A.蛋白质分子所带的电荷蛋白质分子所带的电荷蛋白质分子所带的电荷蛋白质分子所带的电荷 B.B.B.B.蛋白质分子的形状蛋白质分子的形状蛋白质分子的形状蛋白质分子的形状 C.C.C.C.蛋白质分子的相对质量蛋白质分子的相对质量蛋白质分子的相对质量蛋白质分子的相对质量 D.D.D.D.缓冲溶液的缓冲溶液的缓冲溶液的缓冲溶液的pHpHpHpHC CA A1.1.分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有的方法分离具有不同物理

9、或化学性质不同物理或化学性质的的生物大分子。生物大分子。2.2.蛋白质分离和提取的原理：蛋白质分离和提取的原理：根据蛋白质根据蛋白质各种特性的差异各种特性的差异，如，如分子的分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，等等，可以用来分离可以用来分离不同种类不同种类的蛋白质。的蛋白质。四、实验操作四、实验操作血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离水水 分分固体物质固体物质血血液液血浆血浆血细血细 胞胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白两个两个两个两个肽链

10、肽链肽链肽链两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团思考思考血液有哪些成分？血液有哪些成分？血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血红蛋白的特点：血红蛋白的特点：血红血红血红血红蛋白蛋白蛋白蛋白两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1.1.样品处理：样品处理：.蛋白质提取和分离步骤蛋白质提取和分离步骤.凝胶色谱法分离蛋白质操作步骤凝胶色谱法分离蛋白质操作步骤思考：思考：人们用鸡的红细胞

11、提取人们用鸡的红细胞提取DNADNA，用用猪、牛、猪、牛、羊羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？答：答：鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNA，便于便于进行进行DNADNA的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。取血红蛋白。洗涤操作：洗涤操作：(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤:洗涤目的洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。化，洗涤次数不可过少。柜式离心

12、机柜式离心机初次离心初次离心后的结果后的结果3 3次洗涤后次洗涤后的结果的结果磁力搅拌器磁力搅拌器搅拌器转子搅拌器转子搅拌器正在工作搅拌器正在工作(2)(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放（使用蒸馏水和甲苯）（使用蒸馏水和甲苯）(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：甲苯层（甲苯层（甲苯层（甲苯层（无色透明无色透明无色透明无色透明）；）；）；）；脂溶性物质沉淀层（脂溶性物质沉淀层（脂溶性物质沉淀层（脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体白色薄层固体）；）；）；）；血红蛋白的水溶液层（血红蛋白的水溶液层（血红蛋白的水溶液层（血红蛋白的水溶液层（红色透明液体红色透明液体红色透

13、明液体红色透明液体）；）；）；）；杂质沉淀层（杂质沉淀层（杂质沉淀层（杂质沉淀层（暗红色暗红色暗红色暗红色）。）。）。）。过滤：过滤：过滤：过滤：除去除去除去除去脂溶性物质沉淀层脂溶性物质沉淀层脂溶性物质沉淀层脂溶性物质沉淀层和和和和杂质沉淀层。杂质沉淀层。杂质沉淀层。杂质沉淀层。(4)(4)透析透析(粗分离粗分离)：过程：取过程：取1ml1ml的血红蛋的血红蛋白溶液装入透析袋中，将白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有透析袋放入盛有300ml300ml的的物质的量浓度为物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212

14、小时。小时。透析目的：除去样品中透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。分子量较小的杂质。利用透析袋透析利用透析袋透析透析过程动画演示透析过程动画演示2.2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作:.凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：凝胶色谱柱的制作：注意事项：注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。残留，蛋白质分离不彻底。.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝

15、胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：注意：注意：注意：注意：1.1.1.1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。的空隙。的空隙。的空隙。2.2.2.2.装填凝胶柱时不得有气泡存在：装填凝胶柱时不得有气泡存在：装填凝胶柱时不得有气泡存在：装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气因为气因为气因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果泡会搅乱洗脱液中蛋

16、白质的洗脱次序，降低分离效果泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在液洗脱瓶，在50cm50cm50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml300ml300ml的的的的20mmol/l20mmol/l20mmol/l20mmol/l的的的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpHpHpH为为为为7.07.07.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡充分洗涤平

17、衡充分洗涤平衡12121212小时小时小时小时。注意：注意：注意：注意：1.1.1.1.液面不要低于凝胶表面，否则液面不要低于凝胶表面，否则液面不要低于凝胶表面，否则液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流可能有气泡混入，影响液体在柱内的流可能有气泡混入，影响液体在柱内的流可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。动与最终生物大分子物质的分离效果。动与最终生物大分子物质的分离效果。动与最终生物大分子物质的分离效果。2.2.2.2.不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒不能发生洗脱液流干，露出

18、凝胶颗粒的现象的现象的现象的现象。50505050cmcmcmcm高高高高装装配配好好的的凝凝胶胶柱柱.样品加入与洗脱样品加入与洗脱调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面调节缓冲液面滴加透析样品滴加透析样品滴加透析样品滴加透析样品注意：注意：注意：注意：正确的加正确的加正确的加正确的加样操作是：样操作是：样操作是：样操作是：1.1.1.1.不要触及并破不要触及并破不要触及并破不要触及并破坏凝胶面。坏凝胶面。坏凝胶面。坏凝胶面。2.2.2.2.贴壁加样。贴壁加样。贴壁加样。贴壁加样。3.3.3.3.使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移动。使吸管管口沿管壁环绕移

19、动。样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床洗脱洗脱洗脱洗脱收集收集收集收集注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。说明色谱柱制作成功。说明色谱柱制作成功。说明色谱柱制作成功。开开始始进进行行层层析析收集得到的纯收集得到的纯化后的蛋白化后的蛋白1 1、(多选多选多选多选)关于血红蛋白分子的叙述正确的是关于血红蛋白分子的叙述正确的是关于血红蛋白分子的叙述正确的是关于血红蛋白分子的叙述正确的是()()A.A.两个

20、两个两个两个肽链，两个肽链，两个肽链，两个肽链，两个 肽链，一个亚铁血红素基团肽链，一个亚铁血红素基团肽链，一个亚铁血红素基团肽链，一个亚铁血红素基团 B.B.两个两个两个两个肽链，两个肽链，两个肽链，两个肽链，两个 肽链，四个亚铁血红素基团肽链，四个亚铁血红素基团肽链，四个亚铁血红素基团肽链，四个亚铁血红素基团 C.C.亚铁血红素能与亚铁血红素能与亚铁血红素能与亚铁血红素能与CO2CO2结合结合结合结合 D.D.血红蛋白在人体主要运输能源物质血红蛋白在人体主要运输能源物质血红蛋白在人体主要运输能源物质血红蛋白在人体主要运输能源物质2.2.2.2.下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质下

21、列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质下列各项中，一般不影响在凝胶色谱法分离蛋白质中的分离度的是中的分离度的是中的分离度的是中的分离度的是()()()()A.A.A.A.层析柱高层析柱高层析柱高层析柱高 B.B.B.B.层析柱的直径层析柱的直径层析柱的直径层析柱的直径 C.C.C.C.缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液缓冲溶液 D.D.D.D.样品的分布样品的分布样品的分布样品的分布3.3.3.3.蛋白质的提取和分离一般分为四步，即蛋白质的提取和分离一般分为四步，即蛋白质的提取和分离一般分为四步，即蛋白质的提取和分离一般分为四步，即、和、和、和、和。后三步常用的方法。后三步常用的方法。后三步常用的方法。后三步常用的方法依次是、依次是、依次是、依次是、。B B粗分离粗分离粗分离粗分离纯化纯化纯化纯化样品处理样品处理样品处理样品处理纯度鉴定纯度鉴定纯度鉴定纯度鉴定透析法透析法透析法透析法凝胶色谱法凝胶色谱法凝胶色谱法凝胶色谱法SDSSDSSDSSDS聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳凝胶电泳BCBC