生物选修3基因工程的基本操作程序上课用.ppt

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1、 1.2 1.2 基因工程的基本操作程序 能够发光的热带能够发光的热带鱼鱼基因工程的基本操作程序（1 1）目的基因的获取（2 2）（3 3）将目的基因导入受体细胞（4 4）目的基因的检测与鉴定基因基因表达载体表达载体的构建的构建基因工程的基本操作程序：基因工程的基本操作程序：一：目的基因的获取一：目的基因的获取 获取目的基因是实施基因工程的获取目的基因是实施基因工程的第第一步一步。目的基因：主要是指能编码蛋白目的基因：主要是指能编码蛋白质的基因。例如：质的基因。例如：与生物抗逆性相关的基与生物抗逆性相关的基与生物抗逆性相关的基与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因等。因、与优良品质相关的

2、基因等。因、与优良品质相关的基因等。因、与优良品质相关的基因等。获取目的基因的方法：获取目的基因的方法：1.从从基因文库基因文库中提取中提取2.利用利用PCR技术扩增技术扩增基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库 3.化学方法人工合成化学方法人工合成1.1.什么叫基因文库？什么叫基因文库？将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片断，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库：用限制酶切割一种生物的全部DNA，可以得到大量的DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让受体菌不停分裂。这样，每个受体菌包含有特定的基因组DNA

3、片段，整个受体菌群体就包含这种生物的全部基因称为基因组文库。2 2、部分基因文库：、部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库，例：cDNAcDNA文库。用某种生物发育的某个时期的mRNAmRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNAcDNA，与常用载体噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNAcDNA，并能繁殖扩增，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNAcDNA文库。基因组文库的构建模式图通过对受体菌的培养而储存基因基因组DNA文库cDNA文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较cDNA

4、文库和基因组文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因组中内含子 无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以补：原核细胞的基因结构补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录

5、相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区非编码区原核细胞的 基因结构有调控遗传信息表达的核有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中，苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上最重要的是位于编码区上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点。聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子内含

6、子：外显子外显子：结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA真核细胞的 基因结构编码区非编码区非编码区:外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列 有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_ _ _ 和具有和具有调控作用的调控作用的_ 区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与编码

7、相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？真核细胞基因结构一样长吗？连续连续不连续不连续编码区编码区非编码非编码如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息依据：目的基因的有关信息 如：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性（1 1）从基因组文库中获取：）从基因组文库中获取：限制酶限制酶供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体与载体连接与

8、载体连接受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离 以目的基因转录成的信使RNARNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNADNA，然后在DNADNA聚合酶的作用下合成双链DNADNA，即cDNAcDNA，从而获得所需的基因。（2 2）从部分基因文库中获取（例cDNAcDNA文库的构建方法）（3 3）根据已知的氨基酸序列人工合成）根据已知的氨基酸序列人工合成）根据已知的氨基酸序列人工合成）根据已知的氨基酸序列人工合成DNADNA法法法法 ：根据已知蛋白根据已知蛋白根据已知蛋白根据已知蛋白质的氨基酸序列，质的氨基酸序列，质的氨

9、基酸序列，质的氨基酸序列，推测出相应的信使推测出相应的信使推测出相应的信使推测出相应的信使RNARNA序列，然后按序列，然后按序列，然后按序列，然后按照碱基互补配对原照碱基互补配对原照碱基互补配对原照碱基互补配对原则，推测出它的结则，推测出它的结则，推测出它的结则，推测出它的结构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序构基因的核苷酸序列，再通过化学方列，再通过化学方列，再通过化学方列，再通过化学方法，以单核苷酸为法，以单核苷酸为法，以单核苷酸为法，以单核苷酸为原料合成目的基因。原料合成目的基因。原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNAmRN

10、AmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点优点缺点缺点从基因组文库中获取从部分基因文库中获取根据已知氨基根据已知氨基酸合成酸合成DNADNA法法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，专一性工作量大，盲目，专一性差，分离出来的有时并非差，分离出来的有时并非一个基因一个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不很不稳定，要求的技术条件较稳定，

11、要求的技术条件较高高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸对较少仅限于合成核苷酸对较少的简单基因，适用范围小的简单基因，适用范围小4.利用PCR技术扩增目的基因 称多聚酶链式反应穆里斯等人于1988年发明的。PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因1234522557294时间（min）温度（）PCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNADNA双螺旋双螺旋DNADNA单链单链与引物复性与引物复性D DN NA A变变性性形形成成2 2条条单单链链

12、子链延伸子链延伸DNADNA加倍加倍模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶酶活活性性(%)温度温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点7

13、2第2轮结束PCR的基本反应步骤变性90-95C延伸70-75C复性复性55-60CPCRPCR总结总结：变性：加热至9095双链DNA解链成为单链DNA复性：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性复性延伸 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。前提条件：_；原料：_、_、_、_。原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_ _ _（n n为扩增为扩增循环的次数）循环的次数）结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DN

14、A聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板DNAPCR技术扩增与DNA复制的比较PCRPCR技术技术DNADNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子人工合成(基因比较小)DNA合成仪从基因文库中获取从基因文库中获取利用利用PCRPCR技术扩增技术扩增利用化学方法人工合成利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方

15、法归纳：获取目的基因的方法 用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶相同的黏性末端相同的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶1.过程:二基因表达载体构建 核心质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获

16、得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种过程过程:2.构建基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因插入载插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子启动子(抗

17、虫基因首端抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入子、抗虫基因的质粒中插入终止子终止子(抗虫基因末抗虫基因末端端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。抗虫能力。资 料:思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15）不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受

18、体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。3.3.基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动

19、子c、终止子d、标记基因调节基 因操纵基 因结构基因RNA聚合酶半乳糖苷酶 酶酶 RNA聚合酶启动子RNA聚合酶启动子启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。思考思考1 1：表达载体为什么一定要有启动子？表达载体为什么一定要有启动子？（1 1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；（2 2）通过cDNAcDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。思考思考2：终止子的作用是什么？终止子的作用是什么？终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNADNA片

20、断，能终止mRNAmRNA的转录。是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。思考3：标记基因有什么作用？载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。子三部分结构。注意用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到既用到限制酶切割载体，又用到DNADNA连连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键

21、。酸二酯键。启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。对于目的基因表达必不可少。目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方必需以表达载体的方式携带进去。式携带进去。基因工程技术路线三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：常用的受体细胞：常用的受体细胞：常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。物细胞等。物细胞等。物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理：将目的基因导入受体细胞的原理

22、：借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。（一）转化：目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞稳定表达（二）方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法（1）农杆菌转化法特点：易感染双子叶植物和裸子植

23、物，对大多数单子叶植物没有感染能力原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌 基因枪法又称微弹基因枪法又称微弹轰击法，是轰击法，是利用压缩利用压缩气体产生的动力气体产生的动力，将，将包裹在金属颗粒表面包裹在金属颗粒表面的表达载体的表达载体DNADNA打入打入受体细胞中受体细胞中，使目的，使目的基因与其整合并表达基因与其整合并表达的方法。的方法。（2）基因枪法适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花

24、粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于适用于被子植物被子植物胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞（1 1）方法：显微注射法）方法：显微注射法（将基因表达载体提（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到纯，用显微仪注射到受精卵受精卵中）中）（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体提纯含目的基因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫受精卵发育受精卵发育新性状动物新性状动物常用法：Ca2+处理常用菌：大肠

25、杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNADNA3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞处理受体细胞？用用CaCa2 2处理，增加细菌细胞处理，增加细菌细胞壁的通透性壁的通透性培培养养培培养养培培养养导入导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素 的完全培养基的完全培养基含有四环素的含有四环素的完全培养

26、基完全培养基两两种种培培养养基基均均不不能能生生长长大大肠肠杆杆菌菌 Ca2+处理细胞处理细胞形成感受态细胞形成感受态细胞检测检测（培养不具有氨苄青霉素（培养不具有氨苄青霉素 抗性基因和四环素抗性基因的大肠杆菌）抗性基因和四环素抗性基因的大肠杆菌）只有氨苄青霉素只有氨苄青霉素抗性基因质粒抗性基因质粒只具有氨苄青霉素只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌抗性基因大肠杆菌不不具具有有氨氨苄苄青青霉霉素素 抗抗性性基基因因和和四四环环素素抗抗性性积积基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌完全培养基完全培养基导入导入接种培养接种培养接种培养接种培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基

27、完全培养基大大肠肠杆杆菌菌不不含含抗抗四四环环素素基基因因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基证明：证明：大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的基因 四环素四环素抗性基因抗性基因 四环素四环素抗性基因抗性基因存存活活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？存活存活导入导入接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基大大肠肠杆杆菌菌不不含含抗抗四四环环素素基基因因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全

28、培养基证明：证明：大大肠肠杆杆菌菌含含抗抗四四环环素素基基因因证明：证明：大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的基因 四环素四环素抗性基因抗性基因 四环素四环素抗性基因抗性基因完全培养基完全培养基存存活活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？受体生物受体生物 植物植物 动物动物 微生物微生物受体细胞受体细胞导入方法导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）A.将毒素蛋白注射到受精卵中B.将编码毒素蛋白的DNA

29、序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测检测:是否插入目的基因是否插入目的基因是否转录是否转录是否翻译是否翻译鉴定鉴定:分子水平鉴定分子水平鉴定个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNADNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:将含目的基因

30、的将含目的基因的DNADNA片段用放射性同位素等作标记片段用放射性同位素等作标记,以此做以此做探针探针；使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带若显示出杂交带,表明表明染色体已插入染色体染色体已插入染色体DNADNA中。中。（一）检测基因探针基因探针基因探针基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。与目的基因互补的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。

31、DNADNADNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分子分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。的部位，仍然是两条游离的单链。（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法:分

32、 子 杂 交方法:抗原-抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。提取（3 3）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法方法方法抗原抗原抗原抗原-抗体杂交抗体杂交抗体杂交抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗体蛋白质 出现杂交带脱分化组织培养若不能表达，要对若不能表达，要对若不能表达，要对若不能表达，要对抗虫基因再进行抗虫基因再进行抗虫基因再进行抗虫基因再进行修修

33、修修饰饰饰饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达鉴定鉴定 抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。类类型型步骤步骤 检测内容检测内容方法方法结果显示结果显示分分子子检检测测第一第一步步目的基因是否进目的基因是否进入受体细胞入

34、受体细胞DNADNA分子杂交分子杂交（DNADNA和和DNADNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第二第二步步目的基因是否转目的基因是否转录出录出mRNAmRNA分子杂交技术分子杂交技术（DNADNA和和mRNAmRNA之间）之间）是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带第三第三步步目的基因是否翻目的基因是否翻译出蛋白质译出蛋白质抗原抗原抗体杂交抗体杂交是否成功显示是否成功显示出杂交带出杂交带个个体体水水平平鉴鉴定定 包括抗虫、抗病的包括抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及，以确定是否有抗性以及抗性的程度；抗性的程度；基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功

35、能是基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。否相同等。vv目的基因的表达和检测目的基因的表达和检测提示：DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入

36、受体细胞u转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）（动物）4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基

37、因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在在于真核细胞中，大肠杆菌不存

38、在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。寻根问底：根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出农杆菌不能将目的基因不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的诱导的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。酚类诱导物主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中 4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能

39、患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。1.1.下列有关PCRPCR过程的叙述中不正确的是

40、（）A A变性过程中破坏的是DNADNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B B复性过程中引物与DNADNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C C延伸过程中需要DNADNA聚合酶、ATPATP、四种核糖核苷酸D DPCRPCR与细胞内DNADNA复制相比所需要酶的最适温度较高C 3.PCR技术扩增技术扩增DNA,需要的条件是（需要的条件是（）目的基因目的基因 引物引物 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸DNA聚合酶等聚合酶等 mRNA 核糖体核糖体A、B、C、D、A2.2.获取目的基因的方法有多种，下列获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是（不属于目的基因获取方法的是

41、（）A A、从基因组文库中获取、从基因组文库中获取B B、从、从cDNAcDNA文库中获取文库中获取 C C、从含目的基因生物细胞中获取、从含目的基因生物细胞中获取D D、利用、利用PCRPCR技术获取技术获取C2008年诺贝尔化学奖授予了“发现和发展了水母绿色荧光蛋白“的三位科学家。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光。绿色荧光蛋白在该研究中的主要作用是A追踪目的基因在细胞内的复制过程B追踪目的基因插入到染色体上的位置C.追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布D追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构。C继哺乳

42、动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：（1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是_。（2）进行基因转移时，通常要将外源基因转入_中，原因_（3）通常采用_技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组。（4）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的_细胞中特异表达。显微注射技术显微注射技术受精卵受精卵 受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能受精卵（或早期胚胎细胞）具有全能性，可使外源基因在相应的组织细胞中表达。性，可使外源基因在相应的组织细胞中表达。DNA分子杂交分子杂交膀胱上皮膀胱上皮（或早期胚胎）（或早期胚胎）