第8章 酶通论.ppt

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1、第八章 酶通论酶的早期利用酶的早期利用公元前公元前2121世纪，我国人民就会酿酒世纪，我国人民就会酿酒19世纪中叶对发酵本质的探讨18331833年年PayenPayen 和和 PersozPersoz：淀粉糖化酶淀粉糖化酶（diastasediastase）1919世纪世纪7070年代年代 PasteurPasteur：发酵是酵母细发酵是酵母细胞活动的结果胞活动的结果18781878年年khnekhne:Enzyme-“:Enzyme-“在酵母中在酵母中”18971897年年BchnerBchner兄弟：用酵母提取液实兄弟：用酵母提取液实现发酵（现发酵（19071907年的诺贝尔化学奖）年的

2、诺贝尔化学奖）关于酶的化学本质的认识1926年，年，Sumner从刀豆种子中分离、纯从刀豆种子中分离、纯化得到了脲酶结晶，首次证明酶是具有化得到了脲酶结晶，首次证明酶是具有催化活性的蛋白质。（催化活性的蛋白质。（1949年诺贝尔化年诺贝尔化学奖）学奖）1982 年年Cech从四膜虫发现从四膜虫发现rRNA的自身的自身催化作用，并提出了核酶（催化作用，并提出了核酶（ribozyme）的的概念。（概念。（1989年诺贝尔化学奖）年诺贝尔化学奖）酶反应机制的研究1894年年Fisher，锁钥学说。锁钥学说。1903年年Henri，中间复合物学说。中间复合物学说。1913年，年，Michaelis和和

3、Menten提出了酶促动力提出了酶促动力学原理学原理米氏学说。米氏学说。1925年，年，Briggs和和Handane对米氏学说做了一对米氏学说做了一项重要修正，提出稳态学说。项重要修正，提出稳态学说。邹承鲁邹承鲁 60年代初，提出酶蛋白必需基团的化年代初，提出酶蛋白必需基团的化学修饰和活性丧失的定量关系公式和确定必学修饰和活性丧失的定量关系公式和确定必需基团数的方法，分别被称为需基团数的方法，分别被称为“邹氏公式邹氏公式”、“邹氏作图法邹氏作图法”。还提出了酶活性部位的柔。还提出了酶活性部位的柔性学说性学说主要内容主要内容酶催化作用的特点酶催化作用的特点酶的化学本质及其组成酶的化学本质及其组

4、成酶的命名和分类酶的命名和分类酶的专一性酶的专一性酶的活力测定和分离纯化酶的活力测定和分离纯化核酶和抗体酶核酶和抗体酶酶工程简介酶工程简介8.1、酶催化作用的特点、酶催化作用的特点一、酶是催化剂一、酶是催化剂降低酶促反应活化能。降低酶促反应活化能。8.1、酶催化作用的特点、酶催化作用的特点二、酶是生物催化剂二、酶是生物催化剂反应条件温和，常温常压，中性反应条件温和，常温常压，中性PHPH，酶酶易失活。易失活。酶具有很高催化效率，比非催化反应一酶具有很高催化效率，比非催化反应一般可提高般可提高10108 810102020倍。倍。酶具有高度专一性（反应专一性，底物酶具有高度专一性（反应专一性，底

5、物专一性）。专一性）。酶活性受调节控制。酶活性受调节控制。酶活力受到调节和控制酶活力受到调节和控制调节酶浓度调节酶浓度激素控制激素控制反馈调节反馈调节抑制剂或激活剂调节抑制剂或激活剂调节别构调控、共价修饰调节、酶原激活等。别构调控、共价修饰调节、酶原激活等。8.2、酶的化学本质及其组成、酶的化学本质及其组成一、酶的化学本质：一、酶的化学本质：目前发现的大多数酶符合蛋白质的特性，目前发现的大多数酶符合蛋白质的特性，是蛋白质。是蛋白质。有些酶的成分是有些酶的成分是RNARNA，称为核糖酶。称为核糖酶。8.2、酶的化学本质及其组成、酶的化学本质及其组成二、酶的化学组成二、酶的化学组成简单蛋白质：除蛋

6、白质外，不含其它物质。如简单蛋白质：除蛋白质外，不含其它物质。如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。缀合蛋白质：除蛋白质外，还包含了非蛋白组缀合蛋白质：除蛋白质外，还包含了非蛋白组分（辅助因子）。如细胞色素、丙酮酸氧化分（辅助因子）。如细胞色素、丙酮酸氧化酶等。酶等。几个概念：几个概念：脱辅酶脱辅酶（酶蛋白，（酶蛋白，apoenzymeapoenzyme，apoproteinapoprotein）、辅助因子辅助因子（cofactorcofactor）、全全酶酶(holoenzymeholoenzyme)、辅基辅基(prosthetic group)(prosthet

7、ic group)、辅酶辅酶(coenzyme)coenzyme)。8.2、酶的化学本质及其组成、酶的化学本质及其组成三、单体酶、寡聚酶、多酶复合体三、单体酶、寡聚酶、多酶复合体单体酶：通常由一条肽链组成，如溶菌酶。单体酶：通常由一条肽链组成，如溶菌酶。寡聚酶：二个或以上的亚基组成，亚基可以是寡聚酶：二个或以上的亚基组成，亚基可以是相同的，也可不同；通常是偶数个亚基，亚相同的，也可不同；通常是偶数个亚基，亚基之间以次级键结合；如苹果酸脱氢酶、过基之间以次级键结合；如苹果酸脱氢酶、过氧化氢酶。氧化氢酶。多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而多酶复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。如丙酮酸脱

8、氢酶复合体、脂肪酸合成酶成。如丙酮酸脱氢酶复合体、脂肪酸合成酶复合体等。复合体等。8.3、酶的命名与分类习惯命名习惯命名：根据底物或作用性质来进行命名如：根据底物或作用性质来进行命名如淀粉酶、淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、过氧化氢酶。胃蛋白酶、胰蛋白酶、过氧化氢酶。国际系统命名国际系统命名：明确酶催化反应的底物与反应：明确酶催化反应的底物与反应性质，如：性质，如：乙醇：乙醇：NAD+NAD+氧化还原酶氧化还原酶 丙氨酸：丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶酮戊二酸氨基转移酶 脂肪：水解酶脂肪：水解酶8.3、酶的命名与分类酶的国际系统分类酶的国际系统分类 1.1.氧化还原酶类氧化还原酶类2.2.转移酶类转

9、移酶类3.3.水解酶类水解酶类4.4.裂合酶类裂合酶类5.5.异构酶类异构酶类6.6.合成酶（连接酶）类合成酶（连接酶）类EC 2.2.2.2酶的大类酶的亚类酶的亚亚类酶的流水号氧化氧化-还原酶类还原酶类 Oxido-reductasesOxido-reductases氧化氧化-还原酶催化氧化还原酶催化氧化-还原反应。还原反应。主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(dehydrogenasedehydrogenase)和氧化酶和氧化酶(OxidaseOxidase)。如，乳酸如，乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反脱氢酶催化乳酸的脱氢反应：应：转移转移(移换移换)酶类酶类 T

10、ransferasesTransferases转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。水解酶类水解酶类 hydrolaseshydrolases水解酶催化底物的水解反应。水解酶催化底物的水解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，胰蛋白酶例如，胰蛋白酶(trypsintrypsin)催化的肽链的水解催化的肽链的水解反应：反应：裂合（裂解）酶类裂合（裂解）酶类

11、 LyaseLyase主要包括醛缩酶、水化酶（脱水酶）及脱氨酶主要包括醛缩酶、水化酶（脱水酶）及脱氨酶等。等。裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子而形成而形成双键双键的反应及其逆反应。的反应及其逆反应。例如，例如，丙酮酸脱羧酶催化的反应：丙酮酸脱羧酶催化的反应：异构酶类异构酶类 IsomerasesIsomerases异构酶催化各种同分异构体的相互转化，异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，丙氨酸消旋酶催化的反应例如，丙氨酸消旋酶催化的反应。合成酶类合成酶类 LigasesLig

12、ases or or SynthetasesSynthetases合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连接酶，能够催化C-CC-C、C-OC-O、C-N C-N 以及以及C-S C-S 键的形成反应。这类反应必须键的形成反应。这类反应必须与与ATPATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H=A A+B+ATP+H-O-H=A B+ADP+Pi B+ADP+Pi 例如，例如，谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺合成酶催化的反应。催化的反应。8.48.4、酶的专一性、酶的专一性酶的专一性即特异性（酶的专一性即特异性（substrate specificity）指酶对它所作用的底

13、物有严格的选择指酶对它所作用的底物有严格的选择性。一种酶只能作用于某一种或某一类性。一种酶只能作用于某一种或某一类结构性质相似的物质。结构性质相似的物质。酶的专一性类型：酶的专一性类型：结构专一性和立体异构专一性。结构专一性和立体异构专一性。结构专一性结构专一性（）绝对专一性（）绝对专一性（Absolute specificity)有些酶对底物的要求非常严格，只作用有些酶对底物的要求非常严格，只作用于一个特定的底物。这种专一性称为绝于一个特定的底物。这种专一性称为绝对专一性（对专一性（Absolute specificity)。例如：脲酶、麦芽糖酶、淀粉酶、碳酸例如：脲酶、麦芽糖酶、淀粉酶、碳

14、酸酐酶及延胡索酸水化酶（只作用于反丁酐酶及延胡索酸水化酶（只作用于反丁烯二酸）等。烯二酸）等。结构专一性结构专一性（）相对专一性（）相对专一性(Relative Specificity)：对对象不是一种底物，而是一类化合物或一类化象不是一种底物，而是一类化合物或一类化学键。学键。包括：包括：族族(group)专一性（对键两端的基团要求的程专一性（对键两端的基团要求的程度不同，只对其中一个基团要求严格）度不同，只对其中一个基团要求严格）。如如-葡萄糖苷酶，催化由葡萄糖苷酶，催化由-葡萄糖所构成的糖苷水葡萄糖所构成的糖苷水解，但对于糖苷的另一端没有严格要求。胰解，但对于糖苷的另一端没有严格要求。胰

15、蛋白酶，水解硷性氨基酸的羧基形成的肽键。蛋白酶，水解硷性氨基酸的羧基形成的肽键。键键(Bond)专一性专一性。如酯酶催化酯的水解，对于。如酯酶催化酯的水解，对于酯两端的基团没有严格的要求。酯两端的基团没有严格的要求。立体异构专一性立体异构专一性StereochemicalStereochemical SpecificitySpecificity，stereospecificitystereospecificity（）（）旋光异构旋光异构专一性专一性酶的一个重要特性是能专一性地与手性底物结酶的一个重要特性是能专一性地与手性底物结合并催化这类底物发生反应。即当底物具有合并催化这类底物发生反应。即当

16、底物具有旋光异构体时，酶只能作用于其中的一种。旋光异构体时，酶只能作用于其中的一种。例如，例如，淀粉酶淀粉酶只能选择性地水解只能选择性地水解D D葡萄糖形葡萄糖形成的成的1 1，4 4糖苷键；糖苷键；L-L-氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶只能催只能催化化L-L-氨基酸氧化；氨基酸氧化；乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶只对只对L-L-乳酸是乳酸是专一的。专一的。立体异构专一性立体异构专一性StereochemicalStereochemical SpecificitySpecificity，stereospecificitystereospecificity（）（）几何异构专一性几何异构专一性geometrica

17、l specificitygeometrical specificity有些酶只能选择性催化某种几何异构体有些酶只能选择性催化某种几何异构体底物的反应，而对另一种构型则无催化底物的反应，而对另一种构型则无催化作用。作用。如如延胡索酸水合酶延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸即只能催化延胡索酸即反丁烯二酸水合生成苹果酸，对马来反丁烯二酸水合生成苹果酸，对马来酸（顺丁烯二酸）则不起作用酸（顺丁烯二酸）则不起作用。酶作用专一性的假说酶作用专一性的假说锁钥学说锁钥学说（18941894年年Emil FischerEmil Fischer）lock and lock and keykey或模板学说（或模板学说

18、（temolatetemolate）：）：认为整个酶分子认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。把锁一样。酶作用专一性的假说酶作用专一性的假说诱导契合学说诱导契合学说（19581958年年 D.KoshlandD.Koshland)induced fitinduced fit：该学说认为酶表面并没有该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状底物的诱导才形成了互补形状,从而有利

19、从而有利于底物的结合。（四个要点）于底物的结合。（四个要点）诱导契合学说的要点诱导契合学说的要点v酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板的模板v底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结合）一性结合）v当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。基团形成正确的排列。v在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反应结束时，产物从酶表面脱落，酶构象，

20、反应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。又恢复其原来的构象。Induced FitInduced FitInduced Fit catalyzes phosphorylation of glucose to glucose 6-phosphate during glycolysissuch a large change in a proteins conformation is not unusual BUT:not all enzymes undergo such large changes in conformationnot only enzymes change their

21、 conformations;many structural/motor proteins undergo large conformational changes during their cycleshexokinase8.58.5、酶的活力测定和分离纯化、酶的活力测定和分离纯化酶活力酶活力(Enzyme(Enzyme activity)activity)酶活力是指酶催化某酶活力是指酶催化某一反应的能力，通常一反应的能力，通常用反应产物的增加速用反应产物的增加速率来表示。率来表示。测定时通常测定反应测定时通常测定反应初速率。初速率。(以底物浓度以底物浓度的变化在的变化在5%以内的速以内的速

22、率为初速率率为初速率)8.58.5、酶的活力测定和分离纯、酶的活力测定和分离纯化化酶的活力单位（酶的活力单位（U-activity unitU-activity unit）19611961年，提出用年，提出用“国际单位国际单位”（IUIU）表示酶活表示酶活力，即：力，即：1 1个酶活力单位，是指在特定条件下，个酶活力单位，是指在特定条件下，1 1分钟内能转化分钟内能转化1 1微摩尔底物的微摩尔底物的酶量酶量，或转化，或转化底物中底物中1 1微摩尔有关基团的酶量。微摩尔有关基团的酶量。(25(25 C,C,最适最适底物浓度和最适底物浓度和最适pHpH）1IU=1IU=mol/minmol/min

23、19721972年，提出新的酶活力国际单位：最适条件年，提出新的酶活力国际单位：最适条件下，每秒钟能催化下，每秒钟能催化1mol1mol底物转化为产物所需底物转化为产物所需的酶量，定为的酶量，定为1Kat=1mol/s 1Kat=1mol/s 所以：所以：1Kat=60X101Kat=60X106 6 IUIU 酶的比活力：酶的比活力：酶的比活力用来表示酶的纯度，即每酶的比活力用来表示酶的纯度，即每mgmg蛋白质蛋白质所含的酶活力单位。所含的酶活力单位。比活力比活力=活力活力U/mgU/mg蛋白质蛋白质=总活力总活力U/U/总蛋白总蛋白mgmg有时也用单位酶制剂中含有的活力单位来表示，有时也用

24、单位酶制剂中含有的活力单位来表示，如如U/g,U/U/g,U/mLmL。8.58.5、酶的活力测定和分离纯、酶的活力测定和分离纯化化酶活力测定方法酶活力测定方法（1 1）分光光度法（）分光光度法（spectrophotometryspectrophotometry）：多多利用产物在紫外或可见光部分的光吸收性质，利用产物在紫外或可见光部分的光吸收性质，选择适当波长，测定反应过程的进行情况。选择适当波长，测定反应过程的进行情况。简便、节约时间和样品，可以检测简便、节约时间和样品，可以检测nmolnmol/L/L水水平的变化。平的变化。（2 2）荧光法）荧光法(fluorometryfluorome

25、try)：主要利用底物或主要利用底物或产物的荧光性质。灵敏度高，但易受到干扰。产物的荧光性质。灵敏度高，但易受到干扰。（3 3）同位素测定法：）同位素测定法：同位素标记底物，反应后同位素标记底物，反应后经分离，检测产物的脉冲数，即可换算成酶经分离，检测产物的脉冲数，即可换算成酶的活力单位。灵敏度最高。的活力单位。灵敏度最高。（4 4）电化学方法：）电化学方法：pHpH计、计、氧电极法氧电极法农药残留分析农药残留分析分光光度法测乙酰胆碱酯酶活性分光光度法测乙酰胆碱酯酶活性酶的分离与纯化酶的分离与纯化选材选材破碎细胞破碎细胞抽提抽提分离与提纯分离与提纯 盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、柱层析、盐析

26、、有机溶剂沉淀、选择性变性、柱层析、制备电泳；加入制备电泳；加入EDTA可防重金属离子的影响，可防重金属离子的影响，加入巯基乙醇可防酶在制备时被氧化。加入巯基乙醇可防酶在制备时被氧化。结晶结晶保存保存8.68.6、核酶和抗体酶、核酶和抗体酶核酶核酶有些有些RNARNA具有生物催化功能，统称为具有生物催化功能，统称为ribozymeribozyme。19821982年，年，CechCech等以原生动物嗜热四膜虫为材料，等以原生动物嗜热四膜虫为材料，研究研究rRNArRNA的基因转录问题时发现：的基因转录问题时发现：rRNArRNA前体在前体在鸟苷和鸟苷和MgMg2+2+存在下存在下,切除自身的内

27、含子，使两个切除自身的内含子，使两个外显子拼接起来，成为成熟的外显子拼接起来，成为成熟的rRNArRNA分子。分子。进一步研究证明，这个内含子进一步研究证明，这个内含子RNARNA分子具有特分子具有特定的三维结构，可以再进行催化反应。定的三维结构，可以再进行催化反应。8.68.6、核酶和抗体酶、核酶和抗体酶核酶作用的特点核酶作用的特点化学本质：化学本质：RNARNA，DNADNA底物：底物：RNARNA，肽键，葡聚糖，肽键，葡聚糖，DNADNA反应特异性反应特异性(专一性）：碱基专一性）：碱基催化效率：低催化效率：低8.6、核酶和抗体酶、核酶和抗体酶核酶的分类核酶的分类剪切型核酶剪接型核酶根据

28、催化反应锤头核酶I内含子II内含子发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV)核酶RNaseP8.68.6、核酶和抗体酶、核酶和抗体酶抗体酶抗体酶本质上是免疫球蛋白，但是在可变区被赋予了本质上是免疫球蛋白，但是在可变区被赋予了酶的属性，称为酶的属性，称为抗体酶。抗体酶。思路：思路：根据中间复合物学说，酶要与其底物形根据中间复合物学说，酶要与其底物形成过渡态中间复合物，这个复合物中的底物成过渡态中间复合物，这个复合物中的底物处于一种旧键将断未断、新键将成未成的状处于一种旧键将断未断、新键将成未成的状态，叫做过渡态底物。然后，产物才被释放。态，叫做过渡态底物。然后，产物才被释放。反过来，如果有一种物质能够与过渡

29、态底物反过来，如果有一种物质能够与过渡态底物专一接合，那它是否能成为该底物的酶呢？专一接合，那它是否能成为该底物的酶呢？抗体酶的制造方法：抗体酶的制造方法：首先要设计出过渡首先要设计出过渡态底物的类似物。将其注入动物体内，态底物的类似物。将其注入动物体内，诱导出抗体，提取抗体，将它与真正的诱导出抗体，提取抗体，将它与真正的底物反应，看看能不能催化。底物反应，看看能不能催化。应用前景：应用前景：可以产生出自然界不存在的可以产生出自然界不存在的酶，具有不可估量的工业应用前景。原酶，具有不可估量的工业应用前景。原则上来说，今后所有的工业都可以被酶则上来说，今后所有的工业都可以被酶促反应来代替。促反应

30、来代替。8.68.6、核酶和抗体酶、核酶和抗体酶8.78.7、酶工程简介、酶工程简介化学酶工程化学酶工程天然酶天然酶 化学修饰酶化学修饰酶 固定化酶固定化酶 人工模拟酶人工模拟酶 8.78.7、酶工程简介、酶工程简介酶固定的方法有：酶固定的方法有：1 1、交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联、交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成聚合成“网状网状”结构。结构。2 2、偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶、偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。于水的载体上。3 3、包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物、包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。半透膜小胶囊中。4 4、吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或、吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。吸附于离子交换剂上。8.78.7、酶工程简介、酶工程简介生物酶工程生物酶工程用用DNADNA重组技术重组技术(即基因工程技术即基因工程技术)大量大量地生产酶地生产酶(克隆酶克隆酶)；对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶(突变酶突变酶)；设计新的酶基因，合成自然界不曾有过设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。的、性能稳定、催化效率更高的新酶。