医学专题人教版教学课程血红蛋白的提取与分离(二).pptx

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1、请核对导学案答案请核对导学案答案绪绪1.差异性2.来源和性质3.20 、4、2个、2个、亚铁、一分子 氧、一分子二氧化碳4.血红蛋白含量丰富，容易获取。2021/7/19 星期一1（一）样品处理及粗提取（一）样品处理及粗提取1.样品处理、粗分离、纯化 和纯度鉴定。2.血浆、杂蛋白、柠檬酸钠、五、生理盐 水、缓慢、低速短时、上清液没有黄色3.红细胞、等、蒸馏水、甲苯、磁力搅拌器4.血红蛋白、高速离心、无、甲苯、白、脂溶 性沉淀、红、血红蛋白溶液、暗红、破碎物沉 淀、滤纸、脂溶性沉淀、分液漏斗、血红蛋白 溶液5.无机盐离子、有机小分子、透析袋、磷酸缓冲 液2021/7/19 星期一2（二）凝胶色谱

2、操作（二）凝胶色谱操作2.交联程度、膨胀程度和分离范围、得水值、7.5、蒸馏水、均匀、气泡、磷酸缓冲液、紧密。3.管壁、凝胶面、色谱柱底部、5（三）操作提示（三）操作提示1.白细胞2.洗脱液、沸水浴、微生物、空气3.扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序2021/7/19 星期一3请请拿出拿出课本、双色笔、导学案课本、双色笔、导学案 让我们准备好进行思维的碰撞让我们准备好进行思维的碰撞回顾：回顾：1.1.凝胶色谱法和电泳的基本原理？凝胶色谱法和电泳的基本原理？2.2.缓冲溶液的作用？缓冲溶液的作用？请请3组组A1阐述阐述请请5组组A2阐述阐述2021/7/19 星期一4 凝胶色谱法分离蛋白质的原理（根据

3、分子量的大小分子量的大小）相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部通道，路程较长移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，路程较短移动速度较快；相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。凝胶电泳的原理 带电粒子在电场的作用下发生定向迁移，在加入SDS排除电荷多少的影响后，使电泳迁移率完全取决于分子大小，从而达到分离的目的。2021/7/19 星期一5课题3 血红蛋白的提取和分离 实验操作要领知识目标：知识目标：（1）描述描述凝胶色谱分离蛋白质的步骤步骤；（2）理解进行样品的预处理的目的预处理的目的；（3）运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。重、难点：重、难点：（1）描述描述凝胶

4、色谱分离蛋白质步骤步骤；（2）运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。全班同学一起朗读全班同学一起朗读2021/7/19 星期一6蛋白质提取和分离步骤蛋白质提取和分离步骤具具体体操操作作步步骤骤（一）（一）（二）（二）（三）（三）（四）（四）2021/7/19 星期一7哺哺乳乳血血液液血血 浆浆水水 分分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷磷 脂脂葡萄糖等葡萄糖等血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多最多）血红蛋白血红蛋白 （）9090有没有，多不多，易不易有没有，多不多，易不易2021/7/19 星期一81.洗涤红细胞洗涤红细胞1.1 洗涤的目的：洗涤的目的：洗去血液

5、中血浆及血小板等中的洗去血液中血浆及血小板等中的杂蛋白杂蛋白1.2 洗涤过程：洗涤过程：血液血液100mL3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积倍体积生理盐水生理盐水缓慢搅拌缓慢搅拌10min重复洗涤重复洗涤3次，直至上清液没有次，直至上清液没有防止破坏红防止破坏红细胞，使血细胞，使血红蛋白流失红蛋白流失（一）样品处理（一）样品处理黄色黄色2021/7/19 星期一92.血红蛋白的释放血红蛋白的释放原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放血红蛋白原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放血红蛋白2021/7/19 星期一103.分离血红蛋白溶

6、液分离血红蛋白溶液分离过程：分离过程：红细胞红细胞混合液混合液离心管离心管甲苯层甲苯层脂类物质脂类物质血红蛋白层血红蛋白层破碎物沉淀层破碎物沉淀层高速离心高速离心10min 滤纸滤纸过滤过滤脂类物质脂类物质沉淀物沉淀物烧杯烧杯分液分液漏斗漏斗2021/7/19 星期一1120mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液透析的目的是什么？透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质去除血红蛋白中的小分子杂质（二）粗分离（二）粗分离透析血红蛋白透析血红蛋白2021/7/19 星期一12注意事项注意事项（1）生理盐水作用？）生理盐水作用？（3）两次离心的差异？）两次离心的差异？（4）透析袋的作

7、用机理？）透析袋的作用机理？模拟红细胞生存环境，模拟红细胞生存环境，保持红细胞结构完整。保持红细胞结构完整。破碎红细胞；溶解细胞膜破碎红细胞；溶解细胞膜释放血红蛋白。释放血红蛋白。前慢后快，前短后长。前慢后快，前短后长。渗透作用渗透作用（2）蒸馏水和甲苯的作用？）蒸馏水和甲苯的作用？2021/7/19 星期一13（三）纯化（三）纯化1.凝胶色谱柱的制作凝胶色谱柱的制作（2）规格：玻璃管）规格：玻璃管长长40cm，内径，内径1.6cm，两端磨平；，两端磨平；橡皮塞橡皮塞能塞入玻璃管，上平小凹；能塞入玻璃管，上平小凹；移液管移液管0.5mL，长，长5cm；尼龙网尼龙网100目；目；打孔器打孔器移液

8、管能塞入。移液管能塞入。（1）材料：玻璃管，橡皮塞、移液管、尼龙网）材料：玻璃管，橡皮塞、移液管、尼龙网 尼龙管、打孔器、小刀、螺旋夹尼龙管、打孔器、小刀、螺旋夹2021/7/19 星期一142.凝胶色谱柱的填装凝胶色谱柱的填装（1）认识凝胶）认识凝胶Sephadex G75 G:交联程度、膨胀程度、分离范围交联程度、膨胀程度、分离范围 75：凝胶得水值，即每克凝胶膨胀得水：凝胶得水值，即每克凝胶膨胀得水7.5克克（3 3）填装：缓慢一次填装，均匀，紧密、不能有气泡，迅速）填装：缓慢一次填装，均匀，紧密、不能有气泡，迅速 连接缓冲液连接缓冲液（2）认识缓冲液：）认识缓冲液：300mL、20mm

9、ol/L、PH=7.0磷酸缓冲液磷酸缓冲液2021/7/19 星期一153.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱开下端开下端关下端关下端开下端开下端加样加样样品完全渗入样品完全渗入缓冲液面缓冲液面=凝胶面凝胶面关下端关下端加缓冲液加缓冲液接洗脱瓶接洗脱瓶开下端开下端注意：待红色的蛋白质接近柱底是，开始收集，注意：待红色的蛋白质接近柱底是，开始收集，连续收集，每管连续收集，每管5ml疑问：疑问：连续收集得到的连续收集得到的每一管每一管中是否为中是否为同一分子质量同一分子质量的蛋白质？的蛋白质？2021/7/19 星期一16（四）纯度鉴定（四）纯度鉴定电泳电泳1.原理：带电粒子在电场中发生定向迁移，从

10、而把不同质量原理：带电粒子在电场中发生定向迁移，从而把不同质量和电量的粒子分离开。加入电量远大于比粒子自身带电量的和电量的粒子分离开。加入电量远大于比粒子自身带电量的SDS，排除电荷对粒子迁移大小的影响，据此将，排除电荷对粒子迁移大小的影响，据此将不同分子质不同分子质量量的粒子分开。的粒子分开。2.电泳结果分析电泳结果分析如果出现一个条带：样品中含有如果出现一个条带：样品中含有一个分子质量级别一个分子质量级别多肽；多肽；如果出现两个条带：样品中含有如果出现两个条带：样品中含有两个分子质量级别两个分子质量级别多肽。多肽。2021/7/19 星期一172021/7/19 星期一182021/7/1

11、9 星期一19题目：题目：（1）探究探究问题问题1、2、3（2）自己存在的其他疑问）自己存在的其他疑问要求：要求：（1）小组长搞好组织调控：先）小组长搞好组织调控：先一对一一对一讨论，再组内跨层讨论，再组内跨层 交流；重点讨论答交流；重点讨论答案案的的科学性；科学性；（2）讨论形成的答案要条）讨论形成的答案要条理清晰、要点化、序号化理清晰、要点化、序号化。帮。帮 助展示同学做好展示准备。助展示同学做好展示准备。A层层 解决全部疑难，并帮助解决全部疑难，并帮助B层完善答案层完善答案,帮助其他同学解决疑难点。帮助其他同学解决疑难点。B层层 解决疑难后，负责展示。解决疑难后，负责展示。C层层 解决疑

12、难解决疑难，狂记狂记导学案自主学习部分导学案自主学习部分。2021/7/19 星期一20展示点评安排展示点评安排题目题目 展示小组展示小组点评小组点评小组 非展示同学非展示同学探究探究1 1讨论完后讨论完后B B、C C层层落实落实基本原理的理解和记基本原理的理解和记忆忆（3 3分钟记住）分钟记住）A A层层及时补充点评及时补充点评探究探究2 2探究探究3 3 点评、拓展、升华点评、拓展、升华 约约1010分钟分钟点评答题规范、答案的正误或全面否，进行答案的补充修正，点评答题规范、答案的正误或全面否，进行答案的补充修正，或知识拓展，或规律方法的总结。或知识拓展，或规律方法的总结。其他同学注意倾

13、听、积极思考其他同学注意倾听、积极思考,重点内容记好笔记。有不明白或重点内容记好笔记。有不明白或有补充的同学要大胆提出。有补充的同学要大胆提出。其它小组可进行补充点评或拓展其它小组可进行补充点评或拓展1B21B24B24B2、5B15B12B12B1、3B13B16B16B17B27B28B28B2要求：要求：展示人及时到位，规范快速、脱稿展示人及时到位，规范快速、脱稿。答案要答案要序号化、要点化序号化、要点化。组长搞好调控，可分工展示。组长搞好调控，可分工展示。准备准备质疑、补充质疑、补充，高效科研小组成员发挥带头作用，高效科研小组成员发挥带头作用。2021/7/19 星期一21要求：要求：

14、1.B1.B层、层、C C层结合学习目标，巩固落实本课的基础知层结合学习目标，巩固落实本课的基础知 识；识；A A层达成目标后，整理合作探究答案。层达成目标后，整理合作探究答案。2.2.组长抽查本组基础知识的掌握情况。组长抽查本组基础知识的掌握情况。（1）记忆凝胶色谱分离蛋白质的步骤；（2）理解进行样品的预处理的目的；2021/7/19 星期一22本节内容目标：获取血红蛋白溶液本节内容目标：获取血红蛋白溶液获获 取取红细胞红细胞（离心）（离心）破碎红细胞，破碎红细胞，释放血红蛋白释放血红蛋白从各从各红细胞红细胞的成分的成分中获中获取血红蛋白取血红蛋白 （离心）（离心）初步纯化初步纯化血红蛋白血

15、红蛋白（透析）（透析）2021/7/19 星期一231.下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述正确的是（下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述正确的是（）多选多选 A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D.可通过可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

16、ACD2.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（）A.可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料 B.用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤红细胞 C.血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D.洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液A 2组组A11组组A22021/7/19 星期一243.样品的加入和洗脱的操作不正确的是（样品的加入和洗脱的操作不正确的是（）A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓 冲液

17、缓慢下降到凝胶面的下面冲液缓慢下降到凝胶面的下面B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D.用吸管小心的将用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要 破坏凝胶面破坏凝胶面4.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是（在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是（）A.气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果B.气泡阻碍蛋白质的运动气泡阻碍蛋白质的运动C.气泡与蛋白质发生化学反应气泡与

18、蛋白质发生化学反应D.气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密A A 5组组A23组组A12021/7/19 星期一256.下列操作正确的是（下列操作正确的是（）A.分离红细胞时采用低速长时间离心分离红细胞时采用低速长时间离心 B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D.透析时要用透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析的磷酸缓冲液，透析12h5.选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是选用红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列是其优点的是 (

19、)多多A.血红蛋白是有色蛋白血红蛋白是有色蛋白 B.红细胞无细胞核红细胞无细胞核C.红细胞蛋白质含量高红细胞蛋白质含量高 D.红细胞红细胞DNA含量高含量高ABC D 4组组A16组组A22021/7/19 星期一267.下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是的是 ()多多A.采集血样后要高速短时问离心获得血细胞采集血样后要高速短时问离心获得血细胞B.洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血 浆蛋白无法除净。浆蛋白无法除净。C.在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放

20、出血红蛋白在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白D.释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂 质分离开来质分离开来 BCD8组组A22021/7/19 星期一278.在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无在蛋白质的提取和分离中，关于对样品处理过程中，分析无误的是误的是 ()A洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐B洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果分离的效果C洗涤过程选用洗涤过程选用0.1%的生理盐水的生理盐水D透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质下透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质下 D 7组组A12021/7/19 星期一28学科助理：学科助理：1.1.回扣目标回扣目标 总结收获总结收获 2.2.评出优秀小组和个人评出优秀小组和个人 谢谢！谢谢！2021/7/19 星期一29