03第三章吸附层析.ppt

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1、第三章第三章 吸附层析吸附层析吸附层析(adsorption chromatography)又称色层法或色谱法。目前，这种方法已作为纯化或鉴定各种化合物的一种重要手段。1903年俄国植物学家茨维特首先将磷酸钙细粉装入玻璃管内使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物色素溶液倾入，让其通过碳酸钙柱，接着用石油醚洗涤发现，各种色层彼此可分开，柱上端呈黄色，较下端呈绿色，这就是早期的吸附层析磷酸钙细粉植物色素溶液石油醚洗涤层析类型 层析方法可根据不同的标准分成若干类型：按流动相分类：液相层析和气相层析；按固定相“床”的形式分类：柱层析、薄板(层)层析、薄膜层析等等，详见表31。第一节第一节 吸附柱层析吸附柱

2、层析 吸附柱层析：是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种层析方法。常用的吸附剂有：极性的和非极性的两种 极性的有：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人 造沸石等，非极性的有：活性炭等。一、常用术语一、常用术语 1固定相固定相固定相是由层析基质组成的。其基质包括：固体物质(如吸附剂、离子 交换剂)液体物质(如固定在纤维素 或硅胶上的溶液)，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附吸附吸附吸附、溶解溶解溶解溶解和交换交换交换交换作用。2流动相流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体液体或气体液体或气体液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又称洗脱剂洗脱剂

3、洗脱剂洗脱剂或洗涤剂洗涤剂洗涤剂洗涤剂(即推动有效成分或杂质向一定方面移动的溶液)。在薄层层析时，流动相又称展层剂展层剂展层剂展层剂。3 3层析层析 以基质为固定相(柱状或薄层状)，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配分配分配分配、吸附吸附吸附吸附或交换交换交换交换作用，最终结果是使混合物得到分离。4操作容量操作容量 即在特定条件下，某种成分与基质反应反应反应反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量饱和容量饱和容量饱和容量；一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。(mmol/g,mg/g,mmol/ml,mg/ml)其数值大，表明基质对某种成分

4、的结合力强；否则反之。5床体积床体积(Vt)通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积(V Vt t)。V Vt t是基质的外水体积(V0 0)和内水体积(Vi i)以及自身体积(Vg g)的总总总总和和和和，即:V V V Vt t t t=V=V=V=V0 0 0 0+V+V+V+Vi i i i+V+V+V+Vg g g g (详见图3-1)6洗脱体积洗脱体积(Ve)洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。用Ve e表示(见图3-7中OB)。7外水体积外水体积(V0)外水体积指基质颗粒之间之间体积的总和。8内水体积内水体积(Vi)内水体积是指基

5、质颗粒内部内部体积体积的总和。9基质体积基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。V0 0、Vi i、Vg g都是随着床体积和基质性质变化而变化的。10膨胀度膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀溶胀后所后所占有的体积用占有的体积用V V表示。即每克溶胀基质所具有表示。即每克溶胀基质所具有的床体积。的床体积。V=Vt/g 一般一般亲水性亲水性基质的膨胀度比基质的膨胀度比疏水性疏水性的的大大。11分配系数和迁移率分配系数和迁移率 分配系数分配系数分配系数分配系数(K):):):):是指一组分在固定相与固定相与固定相与固定相与流动相中含量含量含量含量的

6、比值，常用K表示。迁移率迁移率:是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距距距距离离离离与流动相移动距离距离距离距离之比值比值比值比值，常用Rf表示。K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大。不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。几种物质之间的分配系数或迁移率,其差异程度越大，分离效果就越好。二、基本原理二、基本原理 在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点；吸附位点通过范德瓦尔力(中性分子彼此距离非常近时，产生的一种微弱电磁引力)和静电引力与蛋白质和核酸等等等等生物分子结合；其结合力的大小大小大小大小与各种生物

7、分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。例如 把含结构不同的A、B二种物质的混合溶液加至装有吸附剂的层析柱(见图3-2)；而后，注入适宜的洗脱剂，控制速度让其下流；便可借助A、B两种物质对吸附剂结合力的差异性，将它们二者分离。假如吸附剂对A的结合力小于B时，则B留在柱子上部，A移至柱子的下部。也可以说，A、B二物质在柱上得以分离，是由于A、B二物质在固定相(吸附剂)与流动相(洗脱剂)之间的分配系数(即物质在固定相中的浓度除以它在流动相中的浓度)不同所致。如果A物质分配系数小于B物质时，则A在柱子上移动的速度大于B。因此，混合物在层析柱中的分离过程，实质上是吸附、解吸附、再吸附的连续过程，或者是在固

8、定相与流动相之间连续分配的过程。三、吸附剂三、吸附剂 1吸附剂的选择吸附剂的选择应具备：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质理化性质理化性质理化性质进行的。一般来说，极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是、为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂。否则反之。要选择一个理想的吸附剂必须经过多次试验才能获得。2吸附剂的性质吸附剂的性质 下面简要叙述 羟基磷灰石和硅胶吸附剂的性质 (1)羟基磷灰石（羟基磷灰石（HA）由于HA的吸附容量高，稳定性好(在t85，pH5.

9、5-10.0均可使用)，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其他生命物质方面得到了广泛的应用。HA的CaCa基团基团基团基团和生物分子表面的负电荷基团负电荷基团负电荷基团负电荷基团的相互反应，对生物分子的分离起重要作用起重要作用起重要作用起重要作用。HA的磷酸基团磷酸基团磷酸基团磷酸基团与生物分子表面的阳电荷基团阳电荷基团的相互反应，则仅起次要作用起次要作用起次要作用起次要作用。(2)硅胶（硅胶（silica gel)性质 A含水量 含有很多硅醇基团硅醇基团硅醇基团硅醇基团(-Si-OH)的颗粒状极性极性极性极性吸附剂。它对氨基酸衍生物、甾体激素、皂甙类、类脂及色素等物质有结合力（吸附作用

10、）。吸附作用：待分离物质的结构物质的结构物质的结构物质的结构差异；更重要的是与其本身含水量与其本身含水量与其本身含水量与其本身含水量关系密切：当含水量高时当含水量高时当含水量高时当含水量高时，则结合力小则结合力小则结合力小则结合力小(或活性小或活性小或活性小或活性小)。在硅胶表面的游离水含量大于17后，结合力是很小的，这时仅能用作分配层析的固定相。B粒度 现在使用粒度较细较细的Lichroprepsi 60Merck公司产品，4063pm(相当于200400目)硅胶吸附剂分离植物样品中的很多有效成分很多有效成分，则效果不错。粒度细细，吸附位点多，分布均匀，分离效果好。但，流速慢，分离时间长。一

11、种快速层析装置通过提高操作压（1bar）来加快流速，缩短细颗粒硅胶柱分离样品时间。（见图3-3）装置部件：玻璃柱：长度(715cm)，直径(310cm)，下 部有一活塞。滴液漏斗(溶剂贮瓶)气体流通部件，等。在玻璃柱中先装入干硅胶或湿硅胶吸附剂(作固定相)；随之于其表面铺一层石英砂；尔后加样品溶液并在其顶部安放好滴液漏斗，倾入洗脱剂；与气体流通部件连接；通过控制针式阀门等部件，即可调节气体流速；最终使样品能在15min内得到洗脱和分离。装置部件：玻璃柱：长度(715cm)，直径(310cm)，下端有一活塞。滴液漏斗(溶剂贮瓶)气体流通部件，等。活化 市售的硅胶或处理过的硅胶,置110烘箱进行活

12、化(约1h)。活化的硅胶应马上使用。如当时不用，则要贮存在干燥器或密闭的瓶中，但时间不宜过长。活性测定 要想分离物质重复性好，每次所用的硅胶活性必须一致。活性测定习惯采用6种染料进行。1偶氮苯；2对甲氧基偶氮苯；3苏丹黄；4苏丹红；5对氨基偶氮苯；6对羟基偶氮苯。硅胶活性测定具体操作硅胶活性测定具体操作原理：在吸附柱上，因吸附剂对6种染料吸附的能力不同，所以它们经洗脱后的位置不同，借此即可测定吸附剂的活性级别。具体操作是：取上述6种染料各20mg溶于l0ml苯溶剂中，加50ml石油醚稀释，然后取20ml此溶液加到1.5cml0cm的硅胶柱上，再加20ml苯与石油醚(1：4)的混合液进行冲洗，洗

13、毕根据各种染料的位置，按表3-4找出硅胶的活性级别。活性级别低的活性大，结合力强。表3-4 硅胶活性级别的标准化规格 活性级别 I IIa IIb IIIa IIIb IVa IVb IVc V VI 染料号位置柱顶部 2 3 4 5 6柱中部 2 3 4 5 6柱底部 1 2 3 4 5流出液 1 2 3 4 5活性级别低的活性大，结合力强。四、洗脱剂四、洗脱剂 在吸附层析中用的洗脱剂是液体。通常它也是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。合适的洗脱剂应符合下列条件：纯度较高；稳定性好；能较完全洗脱下所分离的成分；黏度小；易和所需要的成分分开。洗脱剂的选择洗脱剂的选择洗脱剂的选择洗脱剂的选择：根

14、据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。一般蛋白质或核酸蛋白质或核酸蛋白质或核酸蛋白质或核酸被极性强的羟基磷灰石吸附后，要用含有盐盐盐盐梯度的缓冲液洗脱。而甾体或色素甾体或色素甾体或色素甾体或色素等化合物被极性较弱的硅胶硅胶硅胶硅胶吸附后，则可用有机溶剂有机溶剂有机溶剂有机溶剂洗脱。所用洗脱剂的梯度浓度大小和极性强弱的选择，需通过试验确定。五、层析柱的制备与层析操作五、层析柱的制备与层析操作 柱层析的设备主要有：层析柱 部分收集器 磁力搅拌器 恒流泵 检测仪 详见图3-4 1层析柱层析柱 绝多数层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。柱的直径与长度之比，一般为1：101：40。采用极细

15、颗粒吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。2吸附剂的用量吸附剂的用量 根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。当操作容量高时，吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于100倍。3装柱装柱 装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱后，层析柱中基质应符合如下标准：填装均匀、松紧一致、没有气泡装柱的方法分干装法和湿装法两种：干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒人溶剂，此法不易将气泡排尽。而湿装法系先加适量溶剂到柱内，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的

16、吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾人柱中(见图3-5)，待其自然沉降至柱高的1413时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，严防气泡产生。后一种装柱法对各种基质都适用。装好的层析柱应立即与洗脱剂连接，在约50cm高的操作压下(见第五章)，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其达到平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。4上样和洗脱上样和洗脱 当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距

17、固定相表面的高度约5cm计)，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始洗脱(见图3-6)。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定 5.绘制出洗脱曲线绘制出洗脱曲线 根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线 (以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标)。理想的洗脱曲线如图3-7所示。图中的A峰和B峰均呈对称形，二者没有重叠，这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(EFG)、峰高(BE)和半峰高的宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。6吸附剂的再生吸附剂的再生 用过的吸附剂，经适当方法处理后，又恢复其性

18、能的过程称吸附剂的再生。一般不同吸附剂(或基质)的再生方法是不同的。详细操作参阅各章基质的处理方法及有关文献。六、应用与实例六、应用与实例 1应用应用（1）纯化生命物质）纯化生命物质 使用吸附剂的柱层析或分批吸附法使用吸附剂的柱层析或分批吸附法(见实例见实例1)可纯化生命物质。可纯化生命物质。如用羟基磷灰石吸附剂能把酸性、中性和碱性蛋白质分开，也能把不同结构不同结构不同结构不同结构的核酸分开(见图3-8)。用该吸附剂分离含不同磷酸基团磷酸基团的蛋白质和脂类等化合物也是有效的。（2）分离蛋白质的亚基）分离蛋白质的亚基 一般蛋白质经SDS(十二烷基硫酸钠)或Triton X-100(聚氧乙基十六烷

19、基酚醚)等去污剂处理后，会产生分子质量不同的蛋白质亚基。这些物质可通过吸附柱层析方法得到分离(见图3-9)。（3）浓缩溶液）浓缩溶液 有些稀的溶液经层析柱处理后，浓度可大幅度提高。例如，Tiselius把200ml稀的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液上HA层析柱，收集到的洗脱液仅有几毫升，其浓度提高数十倍。2实例实例 用HA层析柱分离胞质型多角体病毒双链RNA 90g胞质B型多角体病毒(CPV)双链RNA混合样品 2g枯草杆菌(Bacillus subtilis)3H-双链DNA 2g枯草杆菌14C-双链DNA上5mm直径的层析柱(内装140mgHTP，用前

20、预先加热的)。用磷酸梯度缓冲液洗脱，其流量为30mlh，以05ml管进行收集。每管收集液经紫外分光光度仪和液闪仪的测定分析，根据得到的数据即可绘制出分离示意图(见图3-10)。从图看出，双链RNA是在低磷酸盐缓冲液中先被洗出先被洗出，而双链DNA则后被洗出。第二节第二节 薄层层析薄层层析 薄层层析(thin layer chromatography，TLC)：是以涂布于玻板玻板玻板玻板或涤纶片涤纶片涤纶片涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。其基本原理和柱层析、纸层析比较相近。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。薄层层析可根据固定相

21、的种类分为：吸附薄层层析(固定相固定相固定相固定相:吸附剂)分配薄层层析(固定相固定相固定相固定相:固定在支持剂上的水 溶液或有机溶剂)离子交换薄层层析(固定相:离子交换剂)等 层析原理 吸附薄层层、分配薄层层析、离子交换薄层层析 分别与吸附柱层析、分配层析、反相层析和离子交换层析相似。薄层层析有以下优点：1展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需15-60min；2设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备；3温度变化和溶剂饱和程度对Rf值（迁移率）影响较小；4可使用腐蚀性显色剂(用淀粉作黏合剂和葡聚糖凝胶作固定相的薄板除外)；5灵敏度高。主要是用于鉴定小分子物质小分子物质小分子物质小分子

22、物质和制备少量样品少量样品少量样品少量样品。各种展层装置示意图薄层层析图谱第三节第三节 聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜层析是1966年之后发展起来的一种层析方法。它可用于酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸碱基、核苷、核苷酸、杂环化合物、合成染料、磺胺、抗菌素、环酮、杀虫剂和维生素B等16161616类化合物类化合物类化合物类化合物的分析。一、基本原理一、基本原理 聚酰胺对极性物质的吸附吸附吸附吸附作用是：由于它(羰基或氨基）能和被分离物（羟基或氧原子）之间形成氢键氢键氢键氢键。如:酚类(包括黄体酮、鞣酸等)和酸类是以羟基与聚酰胺的羰基形成氢键氢键氢键氢键。硝基化合物和醌类

23、则是以氧原子与聚酰胺的形成氢键氢键氢键氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂展层剂展层剂展层剂与被分离物被分离物被分离物被分离物在聚酰胺膜膜膜膜表面竞竞竞竞争争争争形成氢键氢键氢键氢键。展层剂使分离物在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程，就能导致分离物达到分离目的。所以这种层析与其他层析一样，选择适当的溶液作流动相是层析获得满意结果的重要因素之一。二、应用实例二、应用实例 用DNS氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N末端 每条肽链(除环状链外)都有游离的N末端氨基酸，它可与荧光试剂荧光试剂荧光试剂荧光试剂DNS-Cl(二甲氨基萘磺酰氯

24、)结合成DNS-氨基酸复合物。(1)DNS-Cl的性质 DNS-Cl是一种荧光物质，能溶于有机溶剂，在pH9.510.5时，它能与氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸的一级胺、二级胺、巯基、咪唑基和酚羟基缩合成具有黄黄黄黄绿绿绿绿色荧光的衍生物色荧光的衍生物色荧光的衍生物色荧光的衍生物。DNS-氨基酸衍生物比较稳定。另外，DNS-Cl也能与氨和氢氧根分别生成显黄色黄色黄色黄色荧光的DNS-NH2和显蓝色蓝色蓝色蓝色荧光的DNS-OH。（2）展层样品制备 将DNS-Cl与样品氨基酸混合。展层 双向展层。用DNS-氨基酸的聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜(10cmXl0cm)层析，获得一个分离效果较好的双向层析图谱(见图3-19)，仅需3h。在紫外分析仪中观察可见图谱。