核酸提取经验及原理总结.ppt

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1、核酸提取经验及原理总结核酸提取经验及原理总结主办单位：螺旋网主办单位：螺旋网 主讲人：主讲人：wsuquan 时时 间：间：2008.4.21主要内容主要内容一、核酸的发现一、核酸的发现、核酸的分类和功能、核酸的分类和功能、核酸的理化性质核酸的理化性质 二、细胞裂解二、细胞裂解三、核酸提取三、核酸提取四、核酸纯化四、核酸纯化五、核酸检测五、核酸检测六、核酸除杂质六、核酸除杂质核酸的发现核酸的发现 核酸是核酸是1869年米年米 歇尔歇尔(F.Miescher)在脓液在脓液 的白细胞中发现的，他的白细胞中发现的，他 当时称之为核素。阿尔当时称之为核素。阿尔 特曼特曼(R.Altmann)于于188

2、9年年 认识其酸性后，定名为核认识其酸性后，定名为核 酸。核酸分为核糖核酸酸。核酸分为核糖核酸 (RNA)和脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸 (DNA)两大类。两大类。脱氧核糖核酸（脱氧核糖核酸（DNA）lDNADNA分子含有生物物分子含有生物物种的所有遗传信息，种的所有遗传信息，分子量一般都很大分子量一般都很大（除（除RNARNA病毒外）。病毒外）。lDNADNA为双链分子，其为双链分子，其中大多数是链状结构中大多数是链状结构大分子，也有少部分大分子，也有少部分呈环状结构。呈环状结构。核糖核酸（核糖核酸（RNA）RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子，

3、根据RNA的功能，可以分为三种：信使核糖核酸（mRNA）；转运核糖核酸（tRNA）；核蛋白体核糖核酸（rRNA）。核酸的理化性质核酸的理化性质RNA的纯品都呈白色粉末或结晶，的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。则为白色类似石棉样的纤维状物。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐钠盐在水中为在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。，呈黏性胶体

4、溶液。细胞裂解细胞裂解裂解原理裂解原理细胞的裂解方法细胞的裂解方法裂解方法的评价裂解方法的评价样品与裂解液的比例样品与裂解液的比例细胞裂解细胞裂解-裂解原理经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏、维持核酸结构的稳定等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。细胞裂解细胞裂解-细胞的裂解方法机械方法机械方法化学试剂法化学试剂法反复

5、冻融法反复冻融法酶解法酶解法细胞裂解细胞裂解-裂解方法的评价含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组DNA的首选。高浓度蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)的裂解方法，是抽提RNA的首选。含CTAB的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组DNA抽提的首选裂解方法。SDS碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组DNA污染的特点。细胞裂解细胞裂解-样品与裂解液的比例裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影响得率；浓度过高，去除杂质的过程复杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂解液的用量是以样品中蛋白质

6、的含量为基准的，而不是以核酸含量为基准，这一点务必牢记。核酸提取核酸提取提取是使样品中的核酸游离在裂解体系提取是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程。中的过程。DNA提取的几种方法1浓盐法2阴离子去污剂法4水抽提法3苯酚抽提法RNA提取总RNA的试剂盒快速提取蛋白酶热酚法氯化锂法提取总RNA核酸纯化核酸纯化-方法方法经典的使用苯酚/氯仿抽提的纯化技术使用离子交换介质的纯化技术密度梯度离心法使用吸附介质的纯化技术核酸纯化核酸纯化-纯化方法评价针对不同的用途，选择不同的纯化方法，任何一种方法他都有其优缺点，在试验中，没有错误的方法，只是选择的方法不正确。核酸纯化核酸纯化-醇的沉淀沉淀的原理目的沉淀

7、剂的选择沉淀温度的选择核酸纯化核酸纯化-醇的沉淀-目的目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质主要是盐的分离。核酸纯化核酸纯化-醇的沉淀-沉淀剂醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我们没有发现这醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我们没有发现这二者对质量有大的影响，虽然许多人二者对质量有大的影响，虽然许多人“发现发现”乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较白。这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸白。

8、这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。因此，少量核酸不容易丢掉，但比较难洗涤。因此，少量核酸用异丙醇沉淀用异丙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀，大量核酸用乙醇沉淀。核酸纯化核酸纯化-醇的沉淀-温度如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多时，原则上不要使用低温沉淀。低温沉淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时，效果明显；当核酸浓度比较高时，效果不明显，但却会导致杂质的大大增加。核酸纯化核酸纯化-核酸的洗涤洗涤目的方法首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要控制一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时(使核酸沉淀最终蓬松)；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。核酸纯化核酸纯化-核酸的溶解核酸的溶

9、解其中RNA以水为主，DNA则多以弱碱性的Tris或者TE溶解。核酸纯化核酸纯化-核酸保存核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。一般的我们选择，-20或70保存的稳定。如果温度不合适，保存中核酸发生降解或者消失，首要原因是酶残留导致的酶解，第二个原因则是保存核酸溶液的pH值不合适导致的水解。还有一个不为人重视的，就是EP管对核酸的影响。核酸纯化核酸纯化-核酸的浓缩应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。在中等浓度单价阳离子存在下，加入一定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或RNA，也可定量回收。回收的核酸可按所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。核酸质量的检测

10、问题核酸质量的检测问题关于紫外分光光度仪的检测关于紫外分光光度仪的检测关于电泳检测关于电泳检测关于紫外分光光度仪的检测关于紫外分光光度仪的检测在核酸分子中，由在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，具有共轭双键体系，因而具有独特的紫因而具有独特的紫外线吸收光谱，一外线吸收光谱，一般在般在260nm260nm左右有左右有最大吸收峰，可以最大吸收峰，可以作为核酸及其组份作为核酸及其组份定性和定量测定的定性和定量测定的依据。依据。关于电泳检测观察琼脂凝胶中DNA的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固

11、定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。核酸中杂质的去除核酸中杂质的去除肝糖元、淀粉及粘多糖蛋白质的除去不同类型核酸的分离同类核酸的分离核酸中除杂质核酸中除杂质-肝糖元、淀粉及粘多糖取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。核酸中除杂质核酸中除

12、杂质-蛋白质的除去加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。核酸中除杂质核酸中除杂质-不同类型核酸的分离在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提是较有效和常用的方法。在DNA中加核糖核酸酸酶选择地破坏RNA，是除RNA比较有效的方法。核酸中除杂质核酸中除杂质-同类核酸的分离DNA混合物的分离：主要是变性或降解的DNA和天然的分离。RNA混合物的分离经过提取的初步纯化的RNA制品中含有各类RNA和某些已降解的RNA混杂物。进一步纯化时，多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。螺旋网管理团队感谢你参与！螺旋网管理团队感谢你参与！