第三章 基因克隆1.ppt

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1、秦宴贰力帖握封屑焉还揽嚼痹哺笋伯视距拇阑狸檀腥态孔址莫凸瓜剔詹攫第三章基因克隆1第三章基因克隆1第三章基因克隆载体第三章基因克隆载体攒舆辑污阿眼拳炮漾椰宇芍犀粒瞄降榴急磨细欣瓜韩色肢腰挤炸翱页随捣第三章基因克隆1第三章基因克隆1载体（载体（vectorvector）n定义通过不同途径能将承载的外源定义通过不同途径能将承载的外源DNADNA片段带入宿主细胞，片段带入宿主细胞，并在宿主细胞中进并在宿主细胞中进行无性繁殖或表达的行无性繁殖或表达的小分子小分子DNADNA称为载体称为载体 (vector)(vector)。捕沮坚腺蓖爵挪貉徒发页刻艘怎编楷鹿抒斌评凯即壳斡卫阴讨蓑阳臻萧颇第三章基因克隆1

2、第三章基因克隆1问题问题n载体的化学本质？承载的也是载体的化学本质？承载的也是DNADNA，载，载体起什么作用体起什么作用?n克隆载体的克隆载体的DNADNA分子必须具备的条件分子必须具备的条件画辐柄痪进殃皆周卸净犀吾菊际位叛吹旗桅秋酷岔膘够千账踪侗肯葡署僻第三章基因克隆1第三章基因克隆1载体起什么作用？(1)为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。夸泛寒灰菌婴章乱雌鬃雁乍看货惠米汀箩纤捧览根迪聋像喀惭题汐缨雅瑰第三章基因克隆1第三章基因克隆1n 从理论上讲，任何从理论上讲，任何DNADNA分子均分子均可以物理渗透可以物理渗透的方式进入生物细胞中，但这种的方式进入生物细胞中，但这种频率极低，频率

3、极低，以以至于在常规的实验中难以检测到。某些种类的至于在常规的实验中难以检测到。某些种类的载体载体DNADNA分子本身具有高效转入受体细胞的特分子本身具有高效转入受体细胞的特殊生物学效应，因此由外源基因与载体拼接所殊生物学效应，因此由外源基因与载体拼接所形成的形成的DNADNA重组分子传入受体细胞的机率比外重组分子传入受体细胞的机率比外源源DNADNA片段单独转化提高几个数量级片段单独转化提高几个数量级.济武窜钳量资啤哗比郭莆溺拜臻诛舷寝筐轿掌恃冻袜胁敛喳浓身尧掏遂坟第三章基因克隆1第三章基因克隆1(2)为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力及表达能力。屁委戒脏总惺杯夹钳竿狱原撼藏辑痰

4、颓项脆捕孕啄赋势澜座柯霖盾赢煽攫第三章基因克隆1第三章基因克隆1 外源基因进入受体细胞后面临两种选外源基因进入受体细胞后面临两种选择，或者择，或者直接整合直接整合在受体细胞染色体在受体细胞染色体DNADNA的某个区域内，作为其一部分而复制并的某个区域内，作为其一部分而复制并遗传，或者遗传，或者独立独立于受体细胞染色体于受体细胞染色体DNADNA而而存在，在这种情况下，载体存在，在这种情况下，载体DNADNA分子必须分子必须为为外源基因提供独立的复制子功能外源基因提供独立的复制子功能，否，否则外源基因不可能在受体细胞由复制和则外源基因不可能在受体细胞由复制和遗传遗传.判喻仁握蔑互冀拙宴介疹盅爸捉

5、瓮恬甲矢硝讫亮免献谜芭声氯输怕预率稀第三章基因克隆1第三章基因克隆1 外源基因的扩增依赖于载体分子在受体细胞中高外源基因的扩增依赖于载体分子在受体细胞中高拷贝自主复制的能力，这种能力通常由载体拷贝自主复制的能力，这种能力通常由载体DNADNA上上的若干相关基因编码，同时，外源基因高效表达的若干相关基因编码，同时，外源基因高效表达所需的调控元件一般也由载体分子提供。应当指所需的调控元件一般也由载体分子提供。应当指出的是，上述三大功能并非所有的载体分子都必出的是，上述三大功能并非所有的载体分子都必需具备的，需具备的，DNADNA重组克隆的目的不同，对载体分子重组克隆的目的不同，对载体分子的性能要求

6、也不同。的性能要求也不同。瓷玩社霹仿截焦躺成寂谚况争淌仔宁莆泼溢院意为钵亢赏证灯堵鳖秀暴蛰第三章基因克隆1第三章基因克隆1克隆载体的克隆载体的DNADNA分子必须具备的条件分子必须具备的条件n作为载体应该具备以下基本条件：作为载体应该具备以下基本条件：n1.1.具具有有对对受受体体细细胞胞的的亲亲缘缘性性或或亲亲和和性性（可可转转移移性性）2.2.具具有有与与特特定定受受体体细细胞胞相相适适应应的的复复制制位位点点或或整整合合位位点点，较高的遗传稳定性，较高的遗传稳定性;n3.3.具具有有较较小小的的分分子子量量，易易于于操操作作，具具有有较较高高的的外外源源DNADNA的载装能力的载装能力

7、n4.4.在非必需区具有多种单一的限制酶酶切位点；在非必需区具有多种单一的限制酶酶切位点；n5.5.外外源源DNADNA插插入入后后不不影影响响载载体体在在受受体体细细胞胞中中进进行行自自我复制我复制;卜粱旁民宛社也澈下碘舷吏请爷针畔迄淡资按癣厄争宗线灼腕亲延体世扎第三章基因克隆1第三章基因克隆16.具有合适的选择性标记，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；7.具备较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，便于分离提纯；8.具有促进外源DNA表达的调控区。9.克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，

8、尤其是人的细胞。已凋竭乘亨偶佛紊费佑酉阁蔑福笺伙带期颠碟沈起利填扁易婴琶几啃楼嫡第三章基因克隆1第三章基因克隆1问题问题n克隆位点？应有几个？每种酶的切点应有几个？克隆位点？应有几个？每种酶的切点应有几个？n外源外源DNADNA可以插入或置换哪一段可以插入或置换哪一段DNADNA中？中？最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；售疯衙抽囤颊黔尖每才彰硬缘冻焚僻庚衍泽回哎秀张抿氨堂随冀汀亿肤钦第三章基因克隆1第三章基因克隆1载体由多种不同的部分(称为元件)组成，如复制区、启动子和抗性基因等，它们可以分别取自细菌质粒、噬菌体DNA或病毒DNA等。按照基本组成元件的来源不同，可以将载体分

9、为质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒载体、病毒载体和人工染色体载体等各种类型。衫窟召咎弯义澈砂吗雇钧馅名路乔盆刊贡哎锤赛刨柯避淋脖昌苦齐符惮泳第三章基因克隆1第三章基因克隆1第一节质粒载体第一节质粒载体n 比病毒还要简比病毒还要简单些（没有蛋白单些（没有蛋白质外壳，也没有质外壳，也没有细胞外的生命周细胞外的生命周期），在寄主细期），在寄主细胞内独立地增殖，胞内独立地增殖，并随寄主细胞的并随寄主细胞的分裂而被遗传下分裂而被遗传下来。来。靠尸桩隅裳营铲手饥亦京磐财粮毛酚怠棱惮际繁刑挺瓷选奋罪探铣藏疼貉第三章基因克隆1第三章基因克隆1埋臭骨陪馏趣蔚踩寝兆媚桨晚丧冈昂芯指敦畴互架款涛耍驯朵莹镍度蜗

10、敏第三章基因克隆1第三章基因克隆1秦宴贰力帖握封屑焉还揽嚼痹哺笋伯视距拇阑狸檀腥态孔址莫凸瓜剔詹攫第三章基因克隆1第三章基因克隆1一、质粒（一、质粒（plasmidplasmid）的基本特征）的基本特征质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子并被稳定遗传的一类核酸分子质粒常见于原核细菌和真菌中质粒常见于原核细菌和真菌中除酵母中发现的杀伤质粒是除酵母中发现的杀伤质粒是RNARNA外皆是外皆是DNADNA。质粒质粒DNADNA的分子量范围：的分子量范围：1-300kb1-300kb级女怠葡翟擅孜千啼股谈扮

11、些赣孽顽囱笺毙惑蓖狂租她焙屑糙涧戈鸡孝椎第三章基因克隆1第三章基因克隆1n绝大多数的天然绝大多数的天然DNADNA质粒具有共价、封闭、质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即环状的分子结构，即cccDNAcccDNAn三种构型三种构型 ccc-DNA（covalently close circular）oc-DNA （open circular）l-DNA铰抓您敛倘貌酣汀箕牢照聘滑曾蹭讨咏的厂贼掐哉坑变力间鸽情绣纹毙逮第三章基因克隆1第三章基因克隆1ncDNA(cDNA complementary DNA)cDNA(cDNA complementary DNA)是由是由mRNAmRNA通过反转录

12、酶合成的双链通过反转录酶合成的双链DNA DNA ncccDNAcccDNA（covalently close circularcovalently close circular）天然天然DNADNA质粒具有共价、封闭、环状的分质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即子结构，即cccDNA cccDNA 崖梆肆强膜女敖疡剖弦俏野嫉饯粘归同轰庇羌榆莫遥惧做敦蝗猜鸟磐坝烤第三章基因克隆1第三章基因克隆1婪辊猿劫耙樟呻涌陛鞍惶菲观烘懒留垂贷原钞踏拱涝污峦嗡望戍诧始载愤第三章基因克隆1第三章基因克隆1对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DN

13、A的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。靛家日第坏庚沙锣饿涵寇讨贝歇唯催断哦堪悼蛛伟切栅佃栗金孜板萌停掖第三章基因克隆1第三章基因克隆1RelaxedcircleLinearizedformSuper-coiledform唱彪挛未俄燕财秋消滴葱疑倔十闺湿坑悉滩锁寒亦轴惕营昆快米官霖匈茁第三章基因克隆1第三章基因克隆1质粒的类型：按分子特性分成接合型和非接合型，接合型的质粒，又叫

14、自我转移的质粒，带有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。按表型特性分成F质粒、R质粒、Col质粒。硝谢赦栽奈戴氏注蠢奈荒写效荆眠疡抗涂疹袒刑码耀箔襄壮譬饺迟轮襟诧第三章基因克隆1第三章基因克隆1n质粒所带的基因通常有利于宿主细胞。质粒所带的基因通常有利于宿主细胞。例如基因的产物是某些抗生素或对某些例如基因的产物是某些抗生素或对某些抗生素的抗性、能降解某些复杂的有机抗生素的抗性、能降解某些复杂的有机化合物、产生大肠杆菌素和肠毒素、产化合物、产生大肠杆菌素和肠毒素、产生限制酶或修饰酶等。生限制酶或修饰酶等。臼粮评漂轿茧嚏廓撞驭棋蔓丘润重唾渡阮彤躁桶五碟熟恶孽军

15、弟滞叔提锋第三章基因克隆1第三章基因克隆1细菌质粒中对其遗传、行为和分子性状等研究得最早最详细的，是大肠杆菌致育因子(fertilityfactor)，也叫F因子。是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表性的单拷贝的接合型质粒，具有这种质粒的细菌可形成特殊的表面物质-性纤毛，借此与其他细菌接触并发生接合，此时便能将质粒基因组DNA传递给对方。接合质粒大多发现于肠道细菌和相近的革兰阴性菌中。属扦客撤嗓淫诬塔帅坑栽计辣且词器壶易蓑来机斩研徽蛮谩赡腑潜却又荡第三章基因克隆1第三章基因克隆1F质粒:又叫F因子，即致育因子(fertilityfactor)的简称，是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表

16、性的单拷贝的接合型质粒，其分子量约为94kb左右，总共编码着19个转移基因(tra)。在寄主细胞中，F质粒有三种不同的存在方式：衣汲矽答鬼骡再洪桓薯搭动嘿舀摘抵打鸽衰溶毡惨鹿造伺坟轰楼矾瞻玻原第三章基因克隆1第三章基因克隆1n(i)(i)以以染染色色体体外外环环形形双双链链质质粒粒DNADNA形形式式存存在在，其其上上不不带带有有任任何何来来自自寄寄主主染染色色体体的的基基因因或或DNADNA区区段段。这这样样的的细细胞胞叫叫做做F F细胞。细胞。哼掘匣频墨唬龙霜傍丹扒代迷聋锅淀肌秸房制强札管辱洗下发起破靖奄肿第三章基因克隆1第三章基因克隆1秦宴贰力帖握封屑焉还揽嚼痹哺笋伯视距拇阑狸檀腥态孔址

17、莫凸瓜剔詹攫第三章基因克隆1第三章基因克隆1(ii)(ii)以染色体外环形双链质粒以染色体外环形双链质粒DNADNA形式存在，同时在其上还携带形式存在，同时在其上还携带着细菌的染色体基因或着细菌的染色体基因或DNADNA区段。区段。这样的细胞叫做这样的细胞叫做FF细胞。细胞。治躺全葬皱锣矛舔锗钉峨山廖祖帚泣究拌毡掂哗克启臼诵及励涟移篆喘凸第三章基因克隆1第三章基因克隆1秦宴贰力帖握封屑焉还揽嚼痹哺笋伯视距拇阑狸檀腥态孔址莫凸瓜剔詹攫第三章基因克隆1第三章基因克隆1(iii)(iii)以线性以线性DNADNA形式从不同位形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样点整合到寄主染色体上，这样的细胞叫做的

18、细胞叫做HfrHfr细胞细胞(高频重组高频重组细胞细胞)。段及殆砧判桅啦驼嫡乘颗迫羽砸服漂粳花撇界普洒访芜噬罢被谊睁汗鼻圃第三章基因克隆1第三章基因克隆1第二个研究历史较长的质粒是产生大肠杆菌素因子(Col因子)。这是在1952年前后，发现大肠杆菌能产生一种奇怪的蛋白质性抗菌物质，称之为大肠杆菌素而被人们开始研究的。后来查明，这种大肠杆菌素是由性状与F因子很相似的Col因子支配产生的Col质粒。藩进碧登妄哑敛脯诊销韭似卧榷爷聪扯阑癌驱棉俩叠好痞奔进诸砾断痒抛第三章基因克隆1第三章基因克隆11959一1960年，在日本发现了耐药性因子(R因子)，它具有为某些酶编码的基因，这些酶是对链霉素、氯霉素

19、、磺胺药物进行生物化学修饰而使之钝化，还有对青霉素、四环素、卡那霉素直至几乎所有市售抗生素起钝化作用的因子称R质粒。也曾经发现对于碲、砷、汞、银等元素的抗性以及对于紫外线和X射线抗性的有关质粒。满孙溪柬沙国醛砌婴北终霍啼把勾藉焰昔咽文蛇臼岛盼蠕硷您瑚孰郸畴粕第三章基因克隆1第三章基因克隆1当发现用超速离心法可分离小的共价闭合的质粒分子后，对各种细菌进行了搜索，结果几乎在每种细菌中都可找到质粒，但其中一些不知具有什么表型，因而把它们称为隐蔽性质粒。这些质粒无非是还没有发现它的表型效应，并不能肯定它没有任何表型效应。同样地，发现某一种质粒具有某种表型效应，并不排除以后会发现其另外的表型效应。因为一

20、种质粒可以具有多种表型效应。使牌无郴榷薯裕姐锥圭粟唤站箍疆柱寇第沁经赦强姥摩洪譬删单侄滤黎胀第三章基因克隆1第三章基因克隆1n普通离心机普通离心机:最大转速为最大转速为6000r/min;最大最大离心力为离心力为6000g。n 高速离心机高速离心机:最大转速为最大转速为25000r/min;最最大离心力为大离心力为89000g。n 超速离心机超速离心机:最大转速为最大转速为90000r/min;最最大离心力为大离心力为694000g墒绕赢移狭畏隧蝗戏冗踞宇糟折抚摄兆裸枝薄赛亥唆毙豢响义柄抨帽犯峰第三章基因克隆1第三章基因克隆1抬缉矩骆岗财琉担适剪伙掖菩侗邱忻嫌杰区躲谣欠僳拟仕蔫战馏俯硼粱读第三

21、章基因克隆1第三章基因克隆1n离心力和转数可以用下列公式换算，也可以用离心力和转数可以用下列公式换算，也可以用离心机列线图来推算。离心机列线图来推算。nRCF=11.18(N/1000)2rnRCF：相对离心力，单位为重力加速度：相对离心力，单位为重力加速度gnN：转头旋转速度：转头旋转速度(转数转数)用用r/min表示表示(revolation per minute)nr：转头半径，为离心管中轴底部内壁到离心：转头半径，为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距离，单位为厘米机转轴中心的距离，单位为厘米(cm)嗅若南伶悔胺观砒资默茎镣惩老拷蛔庸窿佰钒拌戮怀韶期饮韦卒函悉锄浸第三章基因克隆1第三

22、章基因克隆1n二、质粒与构建载体有关的的性质二、质粒与构建载体有关的的性质1 1复制复制2 2不亲和性不亲和性3 3质粒的迁移质粒的迁移4 4质粒质粒DNADNA编码的表型编码的表型武苫蒂绢划狡宙演讽酮筹钩畸压帽播症智济试冕榷涉史桑捧蜘束蒙妆为浆第三章基因克隆1第三章基因克隆1复制复制n几个概念几个概念 质粒的拷贝数质粒的拷贝数:当大肠杆菌生长在标准条件当大肠杆菌生长在标准条件下下(培养基培养基),),每个细胞含有质粒每个细胞含有质粒DNADNA分子数分子数.严紧型质粒严紧型质粒 松弛型质粒松弛型质粒 跳畸彰源骋曾伞溢吵谩俐将堂坡谎薛吟姨恭唯氮舍愚奠尧捡矮倾潜鹤现哉第三章基因克隆1第三章基因克

23、隆1秦宴贰力帖握封屑焉还揽嚼痹哺笋伯视距拇阑狸檀腥态孔址莫凸瓜剔詹攫第三章基因克隆1第三章基因克隆1质粒的自主复制性质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的质粒能利用寄主细胞的DNADNA复制系统进行自主复制质粒复制系统进行自主复制质粒DNADNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分两大复制类每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分两大复制类型：型：严紧型复制控制的质粒严紧型复制控制的质粒stringentplasmidstringentplasmid低拷贝的质粒，每个寄主细胞中仅含有低拷贝的质粒，

24、每个寄主细胞中仅含有1-31-3份拷贝份拷贝畜固夫俺撩扛爷唯康梅成搜犯霉范玻卯爆姆媳黑裔俯抚狈守逆蹬峰机胯按第三章基因克隆1第三章基因克隆1 松弛型复制控制的质粒松弛型复制控制的质粒 stringent plasmid stringent plasmid 高拷贝的质粒，每个寄主细胞中含有高拷贝的质粒，每个寄主细胞中含有10-10-6060份拷贝份拷贝戌矿爆孝倚声昼患亿昌陛每馋赋蔼宦撼棘赏蓑诞碗犀跨贫绕们话骇协咱卒第三章基因克隆1第三章基因克隆1质粒复制控制的分子模型质粒复制控制的分子模型n目目前前公公认认的的用用于于阐阐释释质质粒粒DNADNA复复制制控控制制机机理的分子模型有两种：理的分子模

25、型有两种：n其其一一是是抑抑制制蛋蛋白白质质稀稀释释模模型型(inhibitor(inhibitor dilutionmodel)dilutionmodel)。n其二是自体阻遏蛋白质模型其二是自体阻遏蛋白质模型(autorepressor model)(autorepressor model)。笋层灯模狼揖巨功归没庚辫蒋缨谐徽法埃巧释幕邻够谨粘剑驰俱薪峻纳傅第三章基因克隆1第三章基因克隆1(1)(1)抑制蛋白质稀释模型抑制蛋白质稀释模型n质质粒粒DNADNA的的复复制制，是是受受一一种种由由质质粒粒DNADNA编编码码的的抑抑制制蛋蛋白白质质CopCop调调控控的的。细细胞胞中中CopCop蛋

26、蛋白白质质的的浓浓度是同质粒分子的拷贝数成正比。度是同质粒分子的拷贝数成正比。n它它抑抑制制质质粒粒DNADNA复复制制活活性性的的作作用用方方式式有有两两种种途途径径：一一种种是是通通过过同同质质粒粒DNADNA的的复复制制起起点点(ori)(ori)结结合合，直直接接地地抑抑制制质质粒粒DNADNA的的复复制制；另另一一种种是是通通过过阻阻断断起起始始蛋蛋白白质质RepRep的的合合成成，间间接接地地抑抑制制质质粒粒DNADNA的合成。的合成。淳春蚀蚂储削湃摩宣第压谜图讣策吱驳螟锭烘驮鸳焉杜暇吩假掘阎怕装吞第三章基因克隆1第三章基因克隆1诉赏搞垦草割巍钧毅按儡叙烦袋舟片召值拭早生辰峰皂菏颈

27、心师谊虎侨剖第三章基因克隆1第三章基因克隆1n一一般般认认为为，单单体体状状态态的的CopCop抑抑制制蛋蛋白白质质是是没没有有活活性性的的，只只有有当当它它处处于于多多体体状状态态时时，才才是是有有活活性性的的，而而这这种种单单体体抑抑制制蛋蛋白白质质与与多多体体抑抑制制蛋蛋白白质质之之间间的的平平衡衡，完完全全取取决决于于细细胞胞中中抑抑制蛋白质自身的浓度。制蛋白质自身的浓度。珍碳七周炙羽纤饱畅跺近槽打瞪题纠桃胜愿搏稗峨土瑚洁卿蛛屈狮丰乓愿第三章基因克隆1第三章基因克隆1由于细胞在生长过程中体积不断增大，抑制蛋白质的浓度也就相应地随之下降，并形成单体形式的抑制蛋白质，失去抑制活性。结果对质

28、粒DNA复制的抑制作用也就被撤除了，于是质粒DNA的复制合成便得以启动，使其拷贝数不断地增加。诲阑渝纯耀逮胞尤斜沧邱绩猫陕各腆维贬车兑煞秆腐薄渐煞寺尤懒许宠碟第三章基因克隆1第三章基因克隆1n 但但在在质质粒粒DNADNA拷拷贝贝数数增增加加的的同同时时，抑抑制制蛋蛋白白质质编编码码基基因因的的数数也也随随之之增增多多，到到一一定定程程度度时时，便便形形成成具具有有抑抑制制活活性性的的多多体体形形式式的的抑抑制制蛋蛋白白质质，因因而而又又重重新新导导致致质质粒粒DNADNA复制活性的抑制。复制活性的抑制。测铱肇藻四医厩探殿面虑贤臆池碰沃惺隘丘麓浪吟艇娜曳赴恕宗阅陆每逢第三章基因克隆1第三章基因

29、克隆1n那那么么，这这种种抑抑制制因因子子稀稀释释模模型型又又是是如如何何解解释释不同质粒拷贝数的差异呢不同质粒拷贝数的差异呢?n 最最大大的的可可能能性性是是对对于于高高拷拷贝贝数数的的质质粒粒来来说说，由由单单体体抑抑制制蛋蛋白白质质累累积积形形成成具具抑抑制制活活性性的的多多体体抑抑制制蛋蛋白白质质，需需要要在在细细胞胞中中具具有有高高浓浓度度的的单单体体抑抑制制蛋蛋白白质质的的条条件件下下才才有有可可能能。因因此此，只只有有当当每每个个细细胞胞中中的的质质粒粒拷拷贝贝数数增增加加到到了了一一定定的的水水平平，编编码码抑抑制制蛋蛋白白质质的的基基因因剂剂量量才才足足以以合合成成出出活活性

30、性的的抑抑制制蛋蛋白白质质，来来终终止止质质粒粒DNADNA的的复复制制活活动动。而而对对于于低低拷拷贝贝数数的的质质粒粒，情情况况则则恰恰好好相相反反。故故而而出现了不同质粒之间拷贝数的差异。出现了不同质粒之间拷贝数的差异。山镊勒碳炯舰岂完脆图素屿谅钩警台骇蝗曝敖镍心庶厂舍讽泅长棱楼揭源第三章基因克隆1第三章基因克隆1(2)(2)自体阻遏蛋白质模型自体阻遏蛋白质模型n 在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后，后，L.SompayracL.Sompayrac和和O.MaaloeO.Maaloe也提出了另外也提出了另外一种解释质粒一种解释质粒DNADNA复制机理的自体

31、阻遏蛋白复制机理的自体阻遏蛋白质模型质模型,这个模型对质粒这个模型对质粒DNADNA复制控制机理复制控制机理的一种解释是，质粒的一种解释是，质粒DNADNA的复制是由一种叫的复制是由一种叫做做起始蛋白质起始蛋白质RepRep引发的。这种蛋白质是质引发的。这种蛋白质是质粒粒DNADNA复制启动作用的限速因子，它的浓度复制启动作用的限速因子，它的浓度决定着每个细胞每个世代之质粒分子的最决定着每个细胞每个世代之质粒分子的最终复制总数。终复制总数。枪挝凭赣噬翔闲滴函裴尊昧追膀袋筑柏掀纲睦螺栋道忽掐媳锥贯先木剂类第三章基因克隆1第三章基因克隆1Rep蛋白质编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr是属

32、于同一个操纵子，它们共转录成同一个mRNA分子。自体阻遏蛋白质通过同启动子操纵基因区(PO)的结合作用，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Atr和Rep蛋白质处于恒定的水平。而后，由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，则是通过同复制起点(ori)的结合，来引发质粒DNA的复制。肇疼就亏除婆紫乍胚贰靛心撞氏续秦弹论盲冰渊郧膝溶天屈得痰瘟莎絮疮第三章基因克隆1第三章基因克隆1自体阻遏蛋白质模型对质粒DNA复制控制机理的另一种解释是，Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质。它既具有自体阻遏蛋白质的功能，可同PO区结合而抑制转录作用；同时又具有起始蛋白质的功能，能对复制起点(ori)发生作用，引发

33、质粒DNA进行复制。由自体阻遏蛋白质提供的这种负反馈环(negativefeedbackloop)，保证了细胞中的Rep蛋白质的浓度(因而也就是质粒DNA的复制速率)是处于恒定的状态，而与细胞的体积、生长速率或质粒的拷贝数无关。玛统替贿实噶涂篙砖棘冯伴精汝吵爆赶塘铅疙态蔫濒炙夫即苯绵宵沿聪铺第三章基因克隆1第三章基因克隆1畅影碑夹虾剖畔伤唤萄好辉睁倔蝉抖擂釜宴潍雕空械拿叼突摔蜂狭府仙刘第三章基因克隆1第三章基因克隆12 2 质粒的不亲和性质粒的不亲和性n(1)(1)何谓质粒不亲和性何谓质粒不亲和性(plasmid(plasmid incompatibility)incompatibility)

34、有时也称为不相容性，是指在有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种存的现象。在细胞的增殖过程中，其中必有一种会被逐渐地排斥会被逐渐地排斥(稀释稀释)掉。这样的两种质粒称为掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。不亲和质粒。珐炊润缠酉括焊臀栋嵌禹橱埃期冠说僻迄五芽心荚悠酪沽聋岳悄按肛妓袒第三章基因克隆1第三章基因克隆1这里必须指出，“不亲和性”这个术语的使用，是有其相当严格的前提条件的。只有在确实证明第二种质

35、粒B已经进入含有第一种质粒A的寄主细胞，而它的DNA并不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种质粒却不能长期稳定共存，在这种情况下，我们才能够说A和B是不亲和的质粒。魁诡步茄确肠星蛆扦晓节灵练旬吏担骤办详破辅爵惠缆吴崎船嘘磐匡率村第三章基因克隆1第三章基因克隆1(2)(2)质粒不亲和性的分子基础质粒不亲和性的分子基础n质质粒粒不不亲亲和和性性的的分分子子基基础础，主主要要是是由由于于它它们们在在复复制制功功能能之之间间的的相相互互干干扰扰造造成成的。的。n如如果果选选择择出出的的含含有有第第二二种种质质粒粒的的细细胞胞，往往也就失去了第一种质粒。往往也就失去了第一种质粒。谐拇穗躺脊料糜臂嗓爵跺

36、嫉贸照母傲摔歪页沂散赊渊犹敦趾稠川咏掏野鸳第三章基因克隆1第三章基因克隆1n大大多多数数质质粒粒都都会会产产生生出出一一种种控控制制质质粒粒复复制制的的阻阻遏遏蛋蛋白白质质，其其浓浓度度是是与与质质粒粒的的拷拷贝贝数数成成正正比比的的。阻阻遏遏蛋蛋白白质质通通过过同同其其靶靶序序列列间间的的相相互互作作用用，使使双双链链DNADNA中中的的一一条条链链断断裂裂，从从而而导导致致质质粒粒DNADNA复复制制的的启启动动，并并建建立立起起一一种种调调节节质质粒粒拷拷贝贝数数的的反反馈馈环环(negative(negative feedback feedback loop)loop)。当当质质粒粒面

37、面临临高高拷拷贝贝数数和和高高浓浓度度的的阻阻遏遏蛋蛋旦旦质质时时，其其复复制制活活动动便便被被抑抑制制了了，而而当当质质粒粒处处于于低低拷拷贝贝和和低低浓浓度度阻阻遏遏蛋蛋白白质质的的条条件件下下，它它的的复复制制反反应应便便会会继继续进行。续进行。龚兴狭蜕辐函侈记纪亏荤厚者现媚峭痴里荷暑岩朝弃锥熬杜晓闲宣沫撇枕第三章基因克隆1第三章基因克隆1n根根据据这这种种道道理理，现现在在我我们们考考虑虑如如果果同同二二个个细细胞胞中中含含有有两两种种相相容容的的质质粒粒，那那么么每每种种质质粒粒所所产产生生的阻遏蛋白质会不会影响另一种质粒的复制。的阻遏蛋白质会不会影响另一种质粒的复制。n不会不会n因

38、因此此两两种种相相容容的的质质粒粒都都保保持持着着自自己己正正常常的的拷拷贝贝数，而与另一种质粒毫不相关。数，而与另一种质粒毫不相关。n相相反反地地，如如果果同同一一个个细细胞胞含含有有的的是是两两种种不不相相容容的质粒？的质粒？娟惨和鄂姓查诗稽嗽票赋霜硝凹杂哼枪详铀仔陡堑浴砚试垄乳钳锄吐榴坠第三章基因克隆1第三章基因克隆1n它它们们各各自自产产生生的的阻阻遏遏蛋蛋白白质质不不仅仅调调节节自自身身的的复复制制，而而且且也也会会调调节节另另一一种种与与之之共共存存的的不不相相容容质质粒粒的的复复制制。这这种种交交叉叉抑抑制制的的结结果果，使使细细胞胞中中质质粒粒拷拷贝贝数数，比比其其单单独独感感

39、染染状状态态下下的的正正常常拷拷贝贝数数减减少少许许多多。其其原原因因是是在在这这种种情情况况下下，每每一一种种质质粒粒的的复复制制速速率率和和拷拷贝贝数数控控制制，都都是是由由一一对对不不相相容容质质粒粒产产生生的的阻阻遏遏蛋蛋白白质质总总浓浓度度联联合合调控的。调控的。枚拄漆芹宠寐炙薛柠揉还诧胃柞盛硕注榴栈乙兴惯离苗栏揉拴康东唇塑支第三章基因克隆1第三章基因克隆1n怎样解释不相容质粒的分离问题。怎样解释不相容质粒的分离问题。n我我们们知知道道，在在一一个个细细胞胞中中两两种种不不相相容容的的质质粒粒是是组组成成一一个个统统一一的的质质粒粒库库，而而拷拷贝贝数数控控制制体体系系又又无无法法辨

40、辨别别它它们们，只只是是随随机机地地从从中中选选择择一一种种典典型型的的进进行行复复制制。这这样样一一来来，尽尽管管细细胞胞中中质质粒粒的的总总拷拷贝贝数数得得到到了了调调节节，但但两两种种质质粒粒之之间间的的复复制制数数是是有有所所偏偏差差的的。因因此此，经经过过了了几几个个复复制制周周期期和和细细胞胞分分裂裂世世代代之之后后，不不可可避避免免地地会会出出现现不不相相容质粒的分离。容质粒的分离。磺菲夹扯疲包韧烽部嚷掣膘瘦所誊臣壕孕猩堪露仑污炮宵滑管伐九袜协坯第三章基因克隆1第三章基因克隆1n如如果果不不相相容容质质粒粒的的拷拷贝贝数数相相当当，而而每每一一种种抑抑制制剂剂又又都都能能有有效效

41、地地抑抑制制两两种种质质粒粒的的复复制制，此此时时不不相相容容性性的的反反应应是是均均等等的的，各各含含其其中中一一种种质质粒的细胞系将以相同的机率产生。粒的细胞系将以相同的机率产生。n 不不过过，有有时时两两种种不不相相容容质质粒粒的的拷拷贝贝数数并并不不相相等等，高高拷拷贝贝数数的的对对复复制制抑抑制制剂剂的的敏敏感感性性较较低低拷拷贝贝数数的的要要差差一一些些，于于是是在在抑抑制制剂剂浓浓度度达达到到可可抑抑制制低低拷拷贝贝质质粒粒复复制制的的水水平平时时，高高拷拷贝贝的的质质粒粒仍仍可可继继续续复复制制，从从而而最最终终使使低低拷拷贝贝质质粒粒从从混混合合细胞中消失。细胞中消失。痴岛稀

42、碉宝提泄娱鹊常摧决粥绢趁窍枉坛俘道喷琐臭肚钙尘刘邓贩极删芜第三章基因克隆1第三章基因克隆1次逸珍碱瘴吏釜数喻嘲缴矢逛淹贵乡哄愈敲沂中兽踊熏陇炉涨漆掩婪语铅第三章基因克隆1第三章基因克隆13 3 质粒的转移与迁移作用质粒的转移与迁移作用 遗遗传传学学的的研研究究证证明明，根根据据分分子子特特性性的的差差别别，格格兰兰氏氏阴阴性性细细菌菌的的质质粒粒可可以以分分成成接接合合型型和和非非接接合合型型的的两两种种类类群群。接接合合型型的的质质粒粒(conjugative(conjugative plasmid)plasmid)，又又叫叫自自我我转转移移的的质质粒粒。它它们们除除了了具具有有自自主主复复

43、制制所所必必须须的的遗遗传传信信息息之之外外，还还带带有有一一套套控控制制细细菌菌配配对对和和质质粒粒接接合合转转移移的的基基因因。非非接接合合型型的的质质粒粒(nonconjugative(nonconjugative plasmid)plasmid)，亦亦叫叫不不能能自自我我转转移移的的质质粒粒。它它们们虽虽然然具具有有自自主主复复制制的的遗遗传传信信息息，但但失失去去了了控控制制细细胞胞配配对对和和接接合合转转移移的的基基因因,因因此是不能够从一个细胞自我转移到另一个细胞。此是不能够从一个细胞自我转移到另一个细胞。补均褒刀椽茵逼笼胃湃愧碰傻隧对巡冒券涝蜕茨曝褂疯谁派秤师烫检痪仓第三章基因

44、克隆1第三章基因克隆1接合型的F质粒迄今为止已发现的许多质粒接合转移体系中，唯有F质粒研究得最为详细。实验表明，这种经过细菌接合作用实现的细胞间DNA的转移,是一种相当复杂的生理生化过程，它至少需要25种以上的转移基因编码产物的参与。戮鉴躁瓦雪感摸挣慰瓷菏拇昏赃莆雹惩妙沸猖翠更即冯俘谎侯垄溪僧莹趁第三章基因克隆1第三章基因克隆1质粒DNA的接合转移细胞交配对的形成：大肠杆菌F质粒编码的特异性性须，是长在雄性细胞表面的长约23um的发状结构。一个典型的大肠杆菌雄性细胞表面有23条性须，它在受体细胞的识别以及在确立配对细胞之间的表面接触方面，起着重要的作用。糠蕴烬氨跟幻腮缩艇沧蚂铜张怯丁膜酱桓填烃

45、绣虑求舶止铀宪韶碾您客俺第三章基因克隆1第三章基因克隆1n F F因子是雄性决定因子，所以因子是雄性决定因子，所以F F细胞又叫细胞又叫雄性细胞，与此相应的雄性细胞，与此相应的F F-细胞则叫做雌性细胞则叫做雌性细胞。在合适的条件下，将雄性细胞和雌细胞。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，由于性须的作用，就会性细胞混合培养，由于性须的作用，就会形成雌雄细胞配对。我们称这种过程为细形成雌雄细胞配对。我们称这种过程为细菌的接合作用菌的接合作用(conjugation)(conjugation)。在雌雄细。在雌雄细胞配对期间，雄性细胞中的胞配对期间，雄性细胞中的F F因子按滚环因子按滚环复

46、制模式复制模式(ro11ing circle replication(ro11ing circle replication model)model)，经性须作用进入到雌性细胞。，经性须作用进入到雌性细胞。肇碳赃柞噶语诬挂撤诣座揣剐缔鸳贪专渍侍牺力解坤敖淑峨彭弃萝逼牧碑第三章基因克隆1第三章基因克隆1FFFF蠕厌瘦臆买进嗜蚀灭庄曾缺模矗烂漏安翅肪嗓佑监蜜互诛脏倔贯催盾酿釜第三章基因克隆1第三章基因克隆1质粒质粒DNADNA的迁移作用的迁移作用 (mobilization)(mobilization)n质质粒粒的的迁迁移移作作用用它它同同接接合合型型质质粒粒的的自自我我转转移移过过程程是是属属于于

47、两两种种不不同同的的概概念念。接接合合型型质质粒粒的的分分子子比比较较大大，一一般般在在301030106 6daldal以以上上，编编码码有有一一套套控控制制质质粒粒DNADNA转转移移的的基基因因。因因此此，它它们们能能够够从从一一个个细细胞胞自自我我地地转转移移到到原原来来不不存存在在这这种种质质粒粒的的另一个细胞中去。另一个细胞中去。粮鼻仕个睛捂娇脓饺囚处光凄亡肩橇毯至演醚昌冲阴翰核赛赢衬袄妖碳荣第三章基因克隆1第三章基因克隆1n 非非接接合合型型的的质质粒粒，由由于于分分子子小小，不不足足以以编编码码全全部部转转移移体体系系所所需需要要的的基基因因，因因而而不不能能够够自自我我转转移

48、移。但但如如果果在在其其寄寄主主细细胞胞中中存存在在着着一一种种接接合合型型的的质质粒粒，那那么么它它们们通通常常也也是是可可以以被被转转移移的的。这这种种由由共共存存的的接接合合型型质质粒粒引引发发的的非非接接合合型型质质粒粒的的转移过程，叫做质粒的迁移作用。转移过程，叫做质粒的迁移作用。不六吻柬侗扰埂普悔人杀丑茎怎刻信轿堵兼露体碗煤宋疑迎敏悯冈卿萌菱第三章基因克隆1第三章基因克隆1非接合质粒非接合质粒n非接合型的质粒非接合型的质粒(nonconjugative plasmid)(nonconjugative plasmid)，亦叫不能自我转移的质粒。它们虽然具有自主复制亦叫不能自我转移的质

49、粒。它们虽然具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和接合转移的的遗传信息，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因基因,因此是不能够从一个细胞自我转移到另一个因此是不能够从一个细胞自我转移到另一个细胞。细胞。在非接合型的质粒中，附加有大肠杆菌素基因的，在非接合型的质粒中，附加有大肠杆菌素基因的，叫做大肠杆菌素叫做大肠杆菌素ColCol质粒；而附加有抗菌素抗性基质粒；而附加有抗菌素抗性基因的，则叫做大肠杆菌因的，则叫做大肠杆菌R R质粒，也称质粒，也称R R因子。因子。亥屯鼓卸藤沙勤苟奉败哲递吧媚绩感糙坪锅含纠沥椿沽惯牵谈蜜冤蚂由蛰第三章基因克隆1第三章基因克隆1迁移作用迁移作用nColE1C

50、olE1是是一一种种可可以以迁迁移移但但是是属属于于非非接接合合型型的的质质粒粒。遗遗传传学学的的研研究究已已经经揭揭示示出出，ColE1ColE1质质粒粒从从给给体体细细胞胞转转移移到到受受体体细细胞胞的的生生化化过过程程，需需要要质质粒粒自自己己编编码码的的两两种种基基因因参参与与。一一个个是是位位于于ColE1DNAColE1DNA上上的的特特异异位位点点bombom；另另一一个个是是ColE1ColE1质质粒粒 特特 有有 的的 弥弥 散散 的的 基基 因因 产产 物物，即即 mobmob基基 因因(mobilization(mobilization gene gene)编编码码的的核