选修3-12基因工程的基本操作程序.ppt

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1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的获取目的基因的获取1基因表达载体的构建基因表达载体的构建23将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定步骤一、目的基因的获取步骤一、目的基因的获取12概念？概念？方法？方法？探究探究1 1互动课堂互动课堂1、目的基因主要是、目的基因主要是编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因毒物降解相关的

2、基因、与工业用酶相关的基因2、也可以是具有调控作用的因子、也可以是具有调控作用的因子方法方法1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因123含义？含义？种类？种类？依据？依据？探探究究2 2互动课堂互动课堂提取某种生物的全部提取某种生物的全部DNADNA用适用适当的当的 限制酶限制酶一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段片段 与与载体连接载体连接导入受体菌中储存导入受体菌中储存基因组文库基因组文库基因组文库的构建基因组文库的构建cDNAcDNA文库的构建文库的构建提取某种生物的某器官提取某种生物的某器官或或特定特定发育时期的发育时期的mRNAmRNA单链单

3、链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体与载体 连接连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNA DNA 聚合酶聚合酶导入受体菌导入受体菌 中储存中储存问题问题1为什么用生物发育某个时为什么用生物发育某个时期的期的mRNA反转录得的反转录得的DNA只有这种生物只有这种生物的部分基因？的部分基因？某个时期的发育是基因选择性表达的结果某个时期的发育是基因选择性表达的结果 怎样从基因文库中获取我们怎样从基因文库中获取我们所需的目的基因呢所需的目的基因呢?（获取依据）（获取依据）根据基因的核苷酸序列、基因的功根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上

4、的位置、基因的转能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物录产物mRNAmRNA、基因的表达产物蛋白质等、基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。特性来获取目的基因。问题问题2原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构(补充内容）补充内容）非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达,上上 游有启动子，下游有终止子游有

5、启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）真核细胞的基因结构（补充内容）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子：能编码蛋白质的序列子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用有调控作用,上游有启动子，下上游有启动子，下游有终止子游有终止子非非编码序列：编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子方法方法2、利用、利用

6、PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因123前提？前提？原理？原理？过程？过程？探探究究3 3互动课堂互动课堂4条件？条件？方法方法2 2、利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCRPCR扩增仪扩增仪(一一)、PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程 1.1.高温变性（高温变性（90-9590-95）：）：双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，断裂，形成断裂，形成_ _ 2.2.低温低温退火（退火（55-6055-60）：）：与与 模板结合模板结合,形成局部双链。形成局部双链。3.3.适温延伸（适温延伸（70-7570-75）：）：合成链在合成链在 作用下延伸，合成互

7、补的作用下延伸，合成互补的DNADNA。TaqTaq酶酶DNADNA引物引物单链单链DNADNA氢键氢键方法方法2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCR之歌PCR之歌TherewasatimewhentoamplifyDNA,Youhadtogrowtonsandtonsoftinycells.ThenalongcameaguynamedDr.KaryMullis,Saidyoucanamplifyinvitrojustaswell.Justmixyourtemplatewithabufferandsomeprimers,Nucleotidesandpolymera

8、ses,too.Denaturing,annealing,andextending.Wellitsamazingwhatheatingandcoolingandheatingwilldo.PCR,whenyouneedtodetectmutations.PCR,whenyouneedtorecombine.PCR,whenyouneedtofindoutwhothedaddyis.PCR,whenyouneedtosolveacrime.从前你要扩增从前你要扩增DNA，总有培养大，总有培养大批细胞的重任要你背。批细胞的重任要你背。这时有个家伙叫这时有个家伙叫KaryMullis博士博士的，他钻

9、出来说体外合成也一样的，他钻出来说体外合成也一样OK！只要把你的模板混上缓冲液，再只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，还有核苷和聚合酶。加些引物，还有核苷和聚合酶。变性，退火，和延伸。变性，退火，和延伸。加热加热冷却冷却加热加热太神奇了！太神奇了！当你想要检测突变，来啊做当你想要检测突变，来啊做PCR吧！吧！当你想要基因重组，来啊做当你想要基因重组，来啊做PCR吧！吧！当你想知道孩子他爹到底是谁，当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做来啊做PCR吧吧!当你想要侦破大案，来啊做当你想要侦破大案，来啊做PCR（二）操作前提：（二）操作前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物一段已知目的基因的

10、核苷酸序列，以便合成引物引物引物（一小段单链（一小段单链DNADNA）（三）原理：（三）原理：（四）条件（四）条件DNADNA的复制的复制DNADNA聚合酶（耐高温）聚合酶（耐高温）温度控制温度控制原料原料(脱氧核苷酸脱氧核苷酸)模板模板（五）扩增形式：（五）扩增形式：指数形式（指数形式（2n）（目的基因）（目的基因）方法方法3 3：通过：通过DNADNA合成仪直接合成目的基因合成仪直接合成目的基因DNA合成仪合成仪推测推测推测推测合成合成前提前提：基因比较小、核苷酸序列已知基因比较小、核苷酸序列已知蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质的氨基的氨基的氨基的氨基酸顺序酸顺序酸顺序酸顺序mRNAmRNA核苷酸

11、核苷酸核苷酸核苷酸序列序列序列序列基因基因DNA的核苷酸的核苷酸序列序列目的目的目的目的基因基因基因基因步骤二：基因表达载体的构建步骤二：基因表达载体的构建12目的？目的？组成？组成？探探究究4 4互动课堂互动课堂步骤二：基因表达载体的构建步骤二：基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心1目的：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。能够表达和发挥作用。2组成：组成：目的基因目的基因+启动子启动子+终止子终止子+标记基因等标记基因等表达载体的组成表达载体的组成启动子：

12、启动子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，片断，RNARNA聚聚合酶识别和结合的部位合酶识别和结合的部位终止子：终止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片断，能终片断，能终止止mRNAmRNA的转录的转录标记基因：标记基因：鉴别受体细胞中鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来有目的基因的细胞筛选出来基因表达载体的构建过程质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒

13、）同一种同一种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端步骤三：将目的基因导入受体细胞内步骤三：将目的基因导入受体细胞内12转化？转化？方法？方法？探探究究5 5互动课堂互动课堂 步骤三、将目的基因导入受体细胞步骤三、将目的基因导入受体细胞1转化：转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2常用的受体细胞：常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。物细胞等。3目的基因导入受体细胞的目的基因导入受体细胞的原理原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。1 1、目的基因导入植物细胞的方法、目的基因导入植物

14、细胞的方法（1 1）农杆菌转化法农杆菌转化法 农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。物，对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。三、目的基因导入受体细胞三、目的基因导入受体细胞构建基因表达载体构建基因表达载体转入转入农杆菌农杆菌植物细胞植物细胞导入导入稳定维持和表达稳定维持和表达过程：过程：1 1、目的基因导入植物细胞的方法、目的基因导入植物细胞的方法（2 2）基因枪法

15、：基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞目的基因导入单子叶植物细胞操作方法：利用压缩气体产生的动力操作方法：利用压缩气体产生的动力，将，将包裹在金属粒表面的表达载体包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。适用：适用：单子叶植物单子叶植物1 1、目的基因导入植物细胞的方法、目的基因导入植物细胞的方法（3 3）花粉管通道法：花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花操作方法：在植

16、物花受粉后，花粉形成花粉管还未愈合前期，剪去柱头，然后，滴入粉管还未愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞道进入受体细胞 特点特点:十分简便经济。十分简便经济。例：转基因抗虫棉例：转基因抗虫棉2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：方法：显微注射法显微注射法目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞微生物作受体细胞原因微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、

17、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少常用菌：大肠杆菌常用菌：大肠杆菌常用法：常用法：CaCa2+2+处理处理获得感受态细胞获得感受态细胞过程：过程：CaCaCaCa2+2+2+2+处理处理处理处理大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态感受态感受态 细胞细胞细胞细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞感受态细胞 吸收吸收吸收吸收DNADNA表达载体表达载体表达载体表达载体与感受态与感受态与感受态与感受态细胞混合细胞混合细胞混合细胞混合 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组入重组DNADNA分子吗？

18、分子吗？1真正能摄入重组真正能摄入重组真正能摄入重组真正能摄入重组DNADNADNADNA分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。分子的受体细胞很少。2目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？维持和表达？不一定，需要检测不一定，需要检测不一定，需要检测不一定，需要检测1 1、鉴定、鉴定分子水平的鉴定分子水平的鉴定转基因生转基因生物的物的DNA探针探针15N N15N N14N N14N N（1 1）检测转基因生物染色体的）检测转基因生物染色体的DNADNA上是否插入了上是否插入了目的基因目的基因基因探针：基因探针：放射性同位素等标

19、记的放射性同位素等标记的含有目的基含有目的基因因DNA片段片段方法方法 DNA分子杂交技术分子杂交技术变性变性变性变性变性变性变性变性1 1、鉴定、鉴定分子水平的鉴定分子水平的鉴定变性变性变性变性方法方法 分子杂交技术分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了）检测目的基因是否转录出了mRNA探针探针15N N15N N转基因生物转基因生物的的mRNA14N N14N N1 1、鉴定、鉴定分子水平的鉴定分子水平的鉴定提提取取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法方法抗原抗原-抗体杂交抗体杂交苏云金杆菌苏云金杆菌Bt毒素蛋白毒素蛋白将将Bt毒蛋白注毒蛋白注射小鼠体内

20、射小鼠体内从小鼠血管抽出从小鼠血管抽出血液分离出抗血液分离出抗Bt毒素的抗体毒素的抗体抗体抗体蛋白质蛋白质出现出现杂交带杂交带脱脱分分化化组组织织培培养养2 2、鉴定鉴定个体水平的鉴定个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。课堂练习1 1、有关基因工程的叙述中，错误的是有关基因工程的叙述中

21、，错误的是()()A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、限制性内切酶用于目的基因的获得、限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、人工合成目的基因不用限制性内切酶、人工合成目的基因不用限制性内切酶A课堂练习2 2、下列属于获取目的基因的方法的是下列属于获取目的基因的方法的是()()利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取 从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合

22、成 A.B.A.B.C.D.C.D.D课堂练习3 3、有关基因工程的叙述正确的是、有关基因工程的叙述正确的是 （）A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料资料D【拓展深化拓展深化】工具酶只有两种：限制酶在操作程序工具酶只有两种：限制酶在操作程序1 1、2 2中用到且中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNADNA连接酶只在操作程

23、序连接酶只在操作程序2 2中用到。中用到。课堂练习4 4、基因工程是在、基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是补配对的步骤是 （）A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C【拓展深化拓展深化】只有第三步将目的基因导入受只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉体细胞不需碱基互补配对，其余三

24、个步骤都涉及碱基互补配对及碱基互补配对课堂练习即时应用即时应用(随学随练，轻松夺冠随学随练，轻松夺冠)5(2009年高考浙江卷年高考浙江卷)下列关于基因工程的叙述，下列关于基因工程的叙述，错误的是错误的是()A目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物物B限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的连接酶是两类常用的工具酶工具酶C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性无生物活性D载体上的抗性基因有利于筛选含重组载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细的细胞和促进目的基因的表达胞和促进目的基因的表达D D