第三组学习资料.pptx

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1、第一部分第一部分:微生物的应用微生物的应用实验目的实验目的:1.进行进行大肠杆菌的扩增大肠杆菌的扩增，利用，利用液体培养基液体培养基进行细进行细菌培养的操作菌培养的操作2.进行进行大肠杆菌的分离大肠杆菌的分离,用用固体平板培养基进行细固体平板培养基进行细菌的划线培养菌的划线培养3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理细菌的常识细菌的常识1、结构、结构2、分裂、分裂3、生殖、生殖4、变异类型、变异类型5、在基因工程中的、在基因工程中的应用应用细菌的外形与大小细菌的外形与大小大肠杆菌属于杆状菌大肠杆菌属于杆状菌图图1-1常见的三种细菌典型形态常见的三种细菌典

2、型形态A.球菌球菌B.杆菌杆菌C.弧菌弧菌n根据细菌所利用的根据细菌所利用的能源和碳源能源和碳源的不同的不同将细菌分为两大营养类型。将细菌分为两大营养类型。n自养菌自养菌:n异养菌异养菌:腐生菌腐生菌寄生菌寄生菌 大部分病原菌大部分病原菌细菌的营养类型细菌的营养类型 光能自养型光能自养型:光合细菌光合细菌化能自养型化能自养型:硝化细菌硝化细菌,铁细菌铁细菌,硫细菌硫细菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌细菌的革兰氏染色细菌的革兰氏染色 革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性革

3、兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌菌。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，。所谓革兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁差别在于细胞壁的成分不同（的成分不同（细胞壁中肽聚糖层的厚度不一致细胞壁中肽聚糖层的厚度不一致）。）。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌大肠杆菌属于革兰氏阴性菌培养基培养基培养基（培养液）是培养基（培养液）是由人工方法配制由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养合营养液。液。固体培养基固体培养基和

4、和液体培养基、半固体培养基液体培养基、半固体培养基。1.1.培养基的类型培养基的类型(三三)细菌的培养细菌的培养成分区别：琼脂成分区别：琼脂2.2.不同的微生物往往需要采用不同的不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方培养基配方 3.3.不管哪种培养基，一般都含有不管哪种培养基，一般都含有水水、碳碳源源、和、和氮源氮源、无机盐无机盐、生长因子生长因子等等营养营养物质，另外还需要满足微生物生长对物质，另外还需要满足微生物生长对pH pH、氧气氧气、渗透压渗透压的要求的要求大肠杆菌配方：酵母提取物大肠杆菌配方：酵母提取物0.5g蛋白胨蛋白胨0.5gNacl0.5g琼脂琼脂1g水水:50ml4.4.

5、培养基的用途培养基的用途液体培养基：液体培养基：扩增细菌扩增细菌、工业生产、工业生产固体培养基：固体培养基：纯化（分离），纯化（分离），鉴定、保鉴定、保藏菌种藏菌种n单个或少数细菌在单个或少数细菌在固体培养基固体培养基上大量繁殖上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的形态结构的子细胞群体子细胞群体，叫做菌落，叫做菌落。n菌落是菌落是鉴定菌种鉴定菌种的重要依据。的重要依据。菌落菌落液体培养基：液体培养基：表面生长表面生长均匀混浊生长均匀混浊生长沉淀生长沉淀生长无菌技术无菌技术1.1.无菌技术的概念无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，

6、无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。所有防止杂菌污染的方法。成功地培养微生物的关键。成功地培养微生物的关键。（）（）消毒定义：消毒定义：2.2.消毒与灭菌的概念及两者的区别消毒与灭菌的概念及两者的区别（2 2）灭菌的定义：）灭菌的定义：3.3.常用的消毒与灭菌的方法常用的消毒与灭菌的方法是指杀灭病原微生物的方法。是指杀灭病原微生物的方法。是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞芽胞、孢子孢子）的方法的方法1 1、灼烧灭菌、灼烧灭菌灭菌的方法：灭菌的方法：2 2、干热灭菌：、干热灭菌：160-170 160-170 下加热下加热1-2h1

7、-2h。3 3、高压蒸气灭菌：、高压蒸气灭菌：100kPa100kPa、121 121 下下维持维持15-30min.15-30min.细菌的培养和分离细菌的培养和分离1 1、实验仪器设备：、实验仪器设备：移液枪移液枪接种环接种环玻璃刮刀玻璃刮刀超净工作台超净工作台高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌锅包器材包器材1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？外来微生物污染外，还有什么目的？2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。如果需要，请选择合适的

8、方法。（1 1）培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2）玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3）实验操作者的双手实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。二、大肠杆菌的培养和分离实验操作二、大肠杆菌的培养和分离实验操作（一）培养基的配置与灭菌（一）培养基的配置与灭菌取取2个个250ml的三角瓶中分别装入的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养液体培养基和基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上固体培

9、养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。LB液体培养基液体培养基细菌的扩大培养细菌的扩大培养LB固体培养基固体培养基细菌的划线分离细菌的划线分离封口膜：既通气封口膜：既通气又不使菌进入又不使菌进入配制培养基LB固体培养基固体培养基市场常见琼脂条市场常见琼脂条（二）倒平板（二）倒平板灭菌后的培养基在灭菌后的培养基在无菌操作台无菌操作台上倒入上倒入4个培养皿中，倒后个培养皿中，倒后立即置于立即置于水平水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面待凝，使之形成平面注意事项：注意事项

10、：1.培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到60左右时，才能用来左右时，才能用来倒平板倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒菌；桌面及人手用酒精棉球消毒3.操作时右手无名指和小指操作时右手无名指和小指夹住封口膜夹住封口膜,另外三指持三另外三指持三角瓶角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边左手拿培养皿并打开上盖的一边,在在酒精灯火焰旁酒精灯火焰旁操作操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板冷凝后，要将平板倒置平板倒置,既可以使培养基表面的

11、既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染基，造成污染.（三）大肠杆菌的扩大培养（三）大肠杆菌的扩大培养将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体灭菌后的液体培养基培养基中中,使其在使其在37摇床培养摇床培养12小时。小时。注意事项注意事项:1.火焰旁火焰旁从斜面上用接种环取菌从斜面上用接种环取菌;2.取菌前取菌前接种环要接种环要用酒精灯用酒精灯灼烧灼烧灭菌灭菌,冷却后方能取菌冷却后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞复原取菌后封口膜和棉塞复原.菌种扩增摇床震荡培养摇床震荡培养12h

12、（于（于LB液体培养基中）液体培养基中）本图来自十一学校（四四）大肠杆菌的划线分离）大肠杆菌的划线分离分离方法分离方法:划线分离法和涂布分离法划线分离法和涂布分离法1、划线分离法、划线分离法无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平板上连续划线平板上连续划线.平板划线的操作平板划线的操作不能使用脱不能使用脱脂棉，否则脂棉，否则容易吸水，容易吸水，造成污染。造成污染。一旦划破，会造成划线不均匀，难一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿

13、着划破形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。处生长，会形成一个条状的菌落。接种、划线划线分离为什么通过划线分离可得到单菌落？为什么通过划线分离可得到单菌落？每划完一个区域要不要灼烧接种环？每划完一个区域要不要灼烧接种环？倒置后做好标记，写在培养皿侧面倒置后做好标记，写在培养皿侧面划线分离（四四）大肠杆菌的划线分离）大肠杆菌的划线分离注意事项注意事项:1.接种环接种环只蘸一次菌液只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置但要在培养基不同位置连续划连续划线多次线多次.2.划线划线首尾不能相接首尾不能相接3.划线后划线后,培养皿培养皿倒置培养倒置培养1224h1、划线分离法、划线分离法

14、 1.1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划每次划线前灼烧接种环是为了线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而环上的菌种直接来源于上次划线的末端

15、，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧划线结束后灼烧接种环，能及时接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。免细菌污染环境和感染操作者。2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？什么总是从上一

16、次划线的末端开始划线？答：答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2、涂布分离法、涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量然后取一定量稀释液加在固体培养基上稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.涂布分离法划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线

17、分离法和涂布分离法哪个更好呢？划线分离：划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。方法简单，但单菌落较难分开。涂布分离：涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。单菌落更易分开，但操作复杂。分离后分离后,一个菌体一个菌体便会形成一个菌便会形成一个菌落落,这是这是消除污染消除污染杂菌的通用方法杂菌的通用方法,也是用于也是用于筛选高筛选高表达量菌株表达量菌株的最的最简便方法之一简便方法之一斜面接种保存斜面接种保存 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用 划线法接种在斜面上。划线法接种在斜面上。3737培养培养24h24h后，后，4 4 冰箱保存。冰箱保存。1.1.如何

18、操作才可以尽量避免被杂菌污染？如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？2.2.在培养后如何判断是否有杂菌污染在培养后如何判断是否有杂菌污染？胆大心细，操作快捷胆大心细，操作快捷 注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染注意灭菌操作原则，灭菌彻底，降低环境污染几率，手和实验服要清洁，减少操作时间，对污染几率，手和实验服要清洁，减少操作时间，对污染源的改善考虑周到源的改善考虑周到 注意微生物生长条件，如注意微生物生长条件，如PHPH、渗透压、温度等。、渗透压、温度等。观察菌落的形态，如颜色、是否透明等观察菌落的形态，如颜色、是否透明等 显微镜镜检观察形态、大小，如是否有菌丝、显微镜镜检观察形态、大小，如

19、是否有菌丝、芽孢等芽孢等 借助化学方法和进一步形态观察，如革兰氏染借助化学方法和进一步形态观察，如革兰氏染色等色等3.3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置？进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置？4.4.试验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理试验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？恒温培养时，培养基的水蒸气会凝结成水恒温培养时，培养基的水蒸气会凝结成水滴留在盖上，如果正放培养皿，水滴会落入培滴留在盖上，如果正放培养皿，水滴会落入培养基表面并且扩散开，容易将菌落中的细菌冲养基表面并且扩散开，容易将菌落中的细菌冲散，难以形成单菌落，达不到分离的目的。散，难以形成单菌落，达不到分离的目的。所有接触过细菌的器皿先高压蒸汽灭菌，所有接触过细菌的器皿先高压蒸汽灭菌，再洗涤，使用后的废弃物也要高压蒸汽灭菌后再洗涤，使用后的废弃物也要高压蒸汽灭菌后再抛弃，取样头和封口膜经清洗后可再使用。再抛弃，取样头和封口膜经清洗后可再使用。