实验三 细胞外周血DNA的提取.ppt

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1、实验三、外周血细胞基因组实验三、外周血细胞基因组DNADNA的提取的提取 (NaINaI法法)基因组基因组DNA提取原理提取原理 Loparev等报道利用等报道利用NaI提取提取DNA的方法，从全血制的方法，从全血制备白细胞备白细胞DNA，可用双蒸水溶涨红细胞及白细胞膜，可用双蒸水溶涨红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核。加释放出血红蛋白及细胞核。加NaI破核膜并使破核膜并使DNA从从核蛋白中解离，用氯仿核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全（异戊醇去泡沫），全（异戊醇去泡沫），DNA存在于上层水相中，以存在于上层水相中，以异丙醇沉淀异丙醇沉淀 DNA，离

2、心弃去异丙醇，并重复操作一，离心弃去异丙醇，并重复操作一次，即可获得白细胞次，即可获得白细胞DNA。氯仿氯仿/异戊醇：使蛋白变性。异戊醇：使蛋白变性。氯仿的作用是蛋白变性剂、抽提脂溶性物质氯仿的作用是蛋白变性剂、抽提脂溶性物质;异戊醇作用是异戊醇作用是A.降低表面张力、阻止气泡的产生降低表面张力、阻止气泡的产生(剧烈震荡时剧烈震荡时容易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用容易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用);B.有助于有助于分相分相(使离心后水相、有机相稳定使离心后水相、有机相稳定)异丙醇：沉淀异丙醇：沉淀DNA70%乙醇：洗涤乙醇：洗涤DNA;(盐、蛋白等溶于盐、蛋白等溶于70%乙醇，

3、而乙醇，而DNA不溶不溶)100%乙醇：可以用于沉淀乙醇：可以用于沉淀DNA，也可以用于使，也可以用于使DNA快速干快速干燥燥限制性核酸内切酶作用原理限制性核酸内切酶作用原理 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNA分子分子中的某种特定核苷酸序列（中的某种特定核苷酸序列（48bp），并对其进），并对其进行切割的核酸内切酶。行切割的核酸内切酶。PCR反应原理反应原理基于基于DNA的半保留复制，两条链都可以作为模板。的半保留复制，两条链都可以作为模板。在体内，在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；数量有限；PCR技术在

4、体外利用人工合成的引物，技术在体外利用人工合成的引物，再加上再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增合成的循环中，达到扩增DNA的目的。的目的。PCR反应反复进行三步骤的循环过程：反应反复进行三步骤的循环过程：热变性热变性退火退火引物延伸引物延伸1）热变性：基因组）热变性：基因组DNA在在95 下加热下加热5分，双螺旋结构被热变分，双螺旋结构被热变性解链为两股单链。性解链为两股单链。2）退火：将反应混合物降温至）退火：将反应混合物降温至5565，引物与上述

5、单链，引物与上述单链DNA上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板引物复合。引物复合。3）引物延伸：将反应混合物调节至）引物延伸：将反应混合物调节至72，在在DNA聚合酶作用下，聚合酶作用下，以以dNTP为原料，从引物为原料，从引物3端开始，沿着端开始，沿着53的方向，按照的方向，按照模板链的序列，合成一条新模板链的序列，合成一条新DNA链，其序列与模板序列互补。链，其序列与模板序列互补。器具和试剂器具和试剂离心机、振离心机、振荡荡器、器、EppendorfEppendorf管，移液器等管，移液器等抗凝人外周血，双蒸水，抗凝人外周血，双蒸水，6M 6M

6、NaINaI溶液，氯溶液，氯仿仿/异戊醇，异戊醇，7070乙醇，乙醇，TETE溶液溶液试剂试剂抗凝人外周血，双蒸水，抗凝人外周血，双蒸水，6M NaI溶液，氯溶液，氯仿仿/异戊醇，异戊醇，70乙醇，乙醇，TE溶液溶液步骤步骤1取外周抗凝血（全血）取外周抗凝血（全血）200ul 于于Eppendorf管中，管中，12000rpm离心离心12min。2.弃上清，加双蒸水弃上清，加双蒸水200ul 溶解，摇匀溶解，摇匀20s。混匀后。混匀后加加6M NaI溶液溶液200ul，充分摇匀，充分摇匀20s。3.加入氯仿加入氯仿/异戊醇（异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇，边加边摇，摇匀匀20s，1

7、2000rpm离心离心12min。步骤步骤4.取上层液取上层液350 ul，加入另一新，加入另一新Eppendorf管中，加管中，加210 ul异丙醇，重新摇匀异丙醇，重新摇匀20s，室温放置，室温放置15min，静置后的反应体系静置后的反应体系15000rpm离心离心12min，使沉淀，使沉淀紧贴紧贴Eppendorf管壁。管壁。5.弃异丙醇，加弃异丙醇，加70乙醇乙醇1ml（不振动，可轻轻颠倒（不振动，可轻轻颠倒混匀），以混匀），以15000rpm离心离心12min。步骤步骤6.弃乙醇，敞开弃乙醇，敞开Eppendorf管盖，烘干（管盖，烘干（37恒温箱）恒温箱）后，加后，加1xTE溶液溶

8、液30ul，溶解，溶解DNA。（制成的。（制成的DNA液置于液置于-20冰箱保存备用）冰箱保存备用）7用用DNARNA Calculator检测检测DNA的含量和纯的含量和纯度。纯度。纯DNA的此比值约为的此比值约为1.82.0。纯。纯RNA的比值的比值约为大于约为大于2.0。步骤步骤8、限制性内切酶酶切：、限制性内切酶酶切：下述各试剂加入下述各试剂加入Eppendorf管内：管内：a、涡旋混匀，短暂离心。、涡旋混匀，短暂离心。b、置恒温水浴箱内，按、置恒温水浴箱内，按EcoR I限制酶的活性温度要求，限制酶的活性温度要求，37酶解过夜酶解过夜C、置于、置于4或或-20保存。保存。人类基因组人

9、类基因组DNA0.1-1 ug10酶解缓冲液酶解缓冲液2 ulEcoR I（10u/uL）1 ul加双蒸水至加双蒸水至 20ul(建议先算好体积，最先加建议先算好体积，最先加)步骤步骤9、聚合酶链式反应：、聚合酶链式反应：a、25 ul标准标准PCR反应体系各成分终浓度如下：反应体系各成分终浓度如下：b、标准、标准PCR反应循环参数：反应循环参数：95：5 min预变性；预变性；94 30s 63 30s、72 60s，共共30个循环；个循环；72 7min。c、置于、置于4或或-20保存。保存。模板模板DNA50100 ngTaq DNA聚合酶聚合酶0.51 uL上游引物上游引物(10 uM)1 uL下游引物下游引物(10 uM)1 uL10DNA聚合酶缓冲液聚合酶缓冲液2.5 uL加双蒸水至加双蒸水至 25ul(建议先算好体积，最先加建议先算好体积，最先加)