105蛋白质工程崛起.ppt

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1、活动活动1：如果想让某一个生物的性状在：如果想让某一个生物的性状在另外一个生物的身上表达，常用的方法另外一个生物的身上表达，常用的方法有哪些？有哪些？基因工程成果丰硕基因工程成果丰硕l植物方面植物方面 提高植物的抗虫、抗病、抗逆性提高植物的抗虫、抗病、抗逆性 改良植物的品质改良植物的品质l动物方面动物方面 提高动物生长速度提高动物生长速度 改善畜产品的品质改善畜产品的品质 用转基因动物生产药物用转基因动物生产药物 用转基因动物作器官移植的供体用转基因动物作器官移植的供体l研制药物研制药物l基因治疗基因治疗科学家面临新的问题科学家面临新的问题在已研究过的几千种酶中，只有极少数可在已研究过的几千种

2、酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。很低。干扰素是由效应干扰素是由效应T细胞产生的糖蛋白，可阻细胞产生的糖蛋白，可阻断细胞分裂间期，抑制断细胞分裂间期，抑制DNA复制，从而可用复制，从而可用于治疗疾病。但干扰素在体外很难保存。于治疗疾病。但干扰素在体外很难保存。玉米中赖氨酸的含量比较低玉米中赖氨酸的含量比较低在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于

3、工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包

4、括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。基酸氧化引起的活性丧失等。干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的扰素的cDNAcDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为扰素的抗病毒活性为106 U/mg106 U/mg，只相当于天然，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的-干干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式

5、存扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，现，-干扰素蛋白质中有干扰素蛋白质中有3 3个半胱氨酸（第个半胱氨酸（第1717位、位、3131位和位和141141位），推测可能是有一个或几个半胱位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第1717位位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的结果使大肠杆菌中生产的-干扰素的抗病性活性干扰素的抗病性活性提高到提高到108 U/mg108

6、 U/mg，并且比天然，并且比天然-干扰素的贮存干扰素的贮存稳定性高很多。稳定性高很多。例如：例如：改造改造干扰素（半胱氨酸）干扰素（半胱氨酸）体外很难保存体外很难保存干扰素（丝氨酸）干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）位的天冬酰胺）改造改造改造改造天冬氨酸激酶（异亮氨酸）天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍玉米中赖氨酸含量可提高数倍蛋白质工程的

7、概念蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。生产和生活的需求。前提前提：了解蛋白质的结构和功能了解蛋白质的结构和功能原理原理：改造基因（基因修饰或基因合成）改造基因（基因修饰或基因合成）目的：目的：定向改造或制造蛋白质定向改造或制造蛋白质基因表达流程图基因表达流程图蛋白质工程流程图蛋白质工程流程图1.从预期的蛋白质功

8、能出发从预期的蛋白质功能出发2.设计预期的蛋白质结构设计预期的蛋白质结构3.推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列4.找到相应的脱氧核苷酸序列找到相应的脱氧核苷酸序列讨论：讨论：1、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。请把相应的碱基序列写出来。活动活动2 某多肽链的一段氨基酸序列是：某多肽链的一段氨基酸序列是：-丙氨酸丙氨酸-色氨酸色氨酸-赖氨酸赖氨酸-甲硫氨酸甲硫氨酸-苯丙氨酸苯丙氨酸-丙氨酸：丙氨酸：GCU、GCC、GCA、GCG 色氨酸：色氨酸：UGG 赖氨酸：赖氨酸：AAA、AAG 甲硫氨酸：甲硫氨酸：AUG 苯

9、丙氨酸：苯丙氨酸：UUU、UUC 每种氨基酸都有对应的三联密码子每种氨基酸都有对应的三联密码子,只要查一下遗传只要查一下遗传密码子表密码子表,就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出就可以将上述氨基酸序列的编码序列查出来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由来。但是由于上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码多个三联密码子编码,因此其碱基排列组合起来就比因此其碱基排列组合起来就比较复杂较复杂,至少可以排列出至少可以排列出16种。同学们可以根据学过种。同学们可以根据学过的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联的排列组合知识自己排列一下。首先应该根据三联密码子推出密码子推出mRNA序

10、列为序列为GCU（或（或C或或A或或G）UGGAAA（或（或G）AUGUUU（或（或C），再根据），再根据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列：碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列：CGA（或（或G或或T或或C）ACCTTT（或（或C）TACAAA（或（或G）。）。2、确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合、确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（成或改造目的基因（DNA）？）？可以通过人工合成的方法获取或基因的定点诱变技可以通过人工合成的方法获取或基因的定点诱变技术来改变。术来改变。基因会发生突变，突变可以自发，也可以诱发，这是每个稍基因会发生突变，突变可以自发，也可以诱发，这是每个

11、稍有生物学知识的人都知道的常识。但在加拿大生物化学家有生物学知识的人都知道的常识。但在加拿大生物化学家M史密斯（史密斯（19322000）发明定点突变法之前，突变株的产）发明定点突变法之前，突变株的产生必须经由自然界或用化学等方法诱使基因体突变。这类方生必须经由自然界或用化学等方法诱使基因体突变。这类方法属于随机突变，突变株必须在生物性状上有所改变，才能法属于随机突变，突变株必须在生物性状上有所改变，才能确定有突变发生，但除非用分子生物方法或遗传方法找到此确定有突变发生，但除非用分子生物方法或遗传方法找到此突变处，否则无法确定突变位置。也就是说，这种突变是盲突变处，否则无法确定突变位置。也就是

12、说，这种突变是盲目的。而史密斯发明的定点突变法却是有目的的，该法可经目的。而史密斯发明的定点突变法却是有目的的，该法可经由设计好的寡核苷酸，在任何一个基因片段上进行随意或设由设计好的寡核苷酸，在任何一个基因片段上进行随意或设计好的突变，也就是说，这种突变是预先设定好的，所以也计好的突变，也就是说，这种突变是预先设定好的，所以也有人将该法称为有人将该法称为“反遗传法反遗传法”。有意思的是这一给生命科学研究及应用领域带来革命性有意思的是这一给生命科学研究及应用领域带来革命性突破的方法竟然是史密斯和其同事在喝咖啡时闲聊出来的。突破的方法竟然是史密斯和其同事在喝咖啡时闲聊出来的。现在，几乎每个生物实验

13、室都会用定点突变法来研究基因或现在，几乎每个生物实验室都会用定点突变法来研究基因或蛋白质的功能。蛋白质的功能。蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：蛋白质工程的主要步骤通常包括：（1 1）从生物体中分离纯化目的蛋白；）从生物体中分离纯化目的蛋白；（2 2）测定其氨基酸序列；）测定其氨基酸序列；（3 3）借借助助核核磁磁共共振振和和X X射射线线晶晶体体衍衍射射等等手手段段，尽尽可可能能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;（4 4）设设计计各各种种处处理理条条件件，了了解解蛋蛋白白质质的的结结构构变变化化，

14、包包括括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；（5 5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如定点突变；）设计编码该蛋白的基因改造方案，如定点突变；（6 6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。（二）蛋白质改造工程举例（二）蛋白质改造工程举例1水蛭素改造水蛭素改造水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由多种变异体，由65或或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素床上可作为抗栓药物用于

15、治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体素主要变异体HV2的设计方案，将的设计方案，将47位的位的Asn（天冬酰（天冬酰胺）变成胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第（赖氨酸），使其与分子内第4或第或第5位位Thr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高4倍，倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。倍。2生长激素改造生长激素

16、改造生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造区

17、有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第侧链，如第18和第和第21位位His（组氨酸）和第（组氨酸）和第17位位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还有大量的工作要做。发作为临床用药还有大量的工作要做。3胰岛素改造胰岛素改造天然胰岛素制剂在储

18、存中易形成二聚体和六聚体，天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。胰岛素已通过临床实验。4治癌酶的改造治癌酶的改造 癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，

19、特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而使这些碱基结构类似物磷酸化而使这些碱基3-OH缺乏缺乏,从而阻断从而阻断DNA的合成，杀死癌细胞。的合成，杀死癌细胞。HSVTK催化能力可以通过催化能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种酶酶,在酶活性部位附近有在酶活性部位附近有6个

20、氨基酸被替换，催化能力个氨基酸被替换，催化能力20倍以上。倍以上。蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍了几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设了几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能计制造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作的一种强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并论。用，可以和任何重大的生物研究方法相提并论。蛋白质工程的进展与前景蛋白质工程的进展与前景蛋白质工程目前的现状：成功

21、的例子不多，蛋白质工程目前的现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。蛋白质的空间结构了解很少。活动活动3 比较基因工程和蛋白质工程比较基因工程和蛋白质工程基因工程基因工程蛋白质工程蛋白质工程相同点相同点都要改造基因，都属于分子水平都要改造基因，都属于分子水平产生新的产生新的基因型，无新基因基因型，无新基因基因（型）基因（型）产生的蛋白质产生的蛋白质原有的原有的新的新的联系联系蛋白质工程以基因工程为基础，蛋白质工程以基因工程为基础，是基因工程的应用和延伸是基因工程的应用和延伸