杨树的植物组织培养.pptx

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1、杨树组织培养一、杨树组织和器官培养（一）杨树离体培养体系建立1.外植体 实际应用中，一般以茎尖和茎段为外植体，诱导率和增殖率较高，并容易获得生根率高的试管苗，也可直接从成年大树上选取幼嫩组织培养。芽的萌动率和增值率收取材季节限制，以冬芽为外植体进行杨树离体快繁时，应在春季芽即将萌动时取材，生长季节取嫩枝段作外植体时，以46月取材为佳。外植体可以直接取自田间，经灭菌后接种；也可取自试管苗，无菌切割后接种。休眠枝经水培后芽萌发枝所获取的外植体也是较好的组培材料。2.外植体灭菌 从健壮母株上选取适宜外植体，洗衣粉液漂洗，毛刷刷净枝条和腋芽处的污物和附着物，流动自来水充分冲洗干净，移入超净工作台。杨树

2、外植体常用消毒方法有两种：第一种是次氯酸钠灭菌法，另一种是氯化汞灭菌法。消毒后用无菌滤纸吸干多余水分，将材料适当分割后接种。通常将嫩枝剪成带顶芽或1个腋芽的12cm茎段;以芽为外植体时要剥除鳞片，以叶片为外植体时可剪成0.51.0cm2 的碎片。3.培养基和培养条件 MS和WPM培养基较为常用。1/4MS和1/2MS培养基在诱导试管苗生根时常用。还有一种大量元素减半的1/2MS培养基，主要用于芽的诱导。常用生长素有NAA、IBA和2,4-D。NAA和IBA广泛用于杨树生根，并与细胞分裂素相互促进芽增殖。2,4-D对杨树愈伤组织诱导有效，对器官分化不利。常用细胞分裂素有KT，6-BA,ZT和2i

3、p等。6-BA在杨树芽的诱导中应用最广。碳水化合物通常使用蔗糖，用量为23g/L。光照以16h/d居多，光照强度影响某些杨树的形态发生，有时弱光或全黑会促进愈伤组织分化和根的再生。培养温度通常为25，适当的昼夜温差有利于试管苗生根和根系生长。4.成苗途径 杨树的成苗途径有：直接诱导单芽苗或丛生芽；直接诱导不定芽；诱导产生愈伤组织。5.生根与移栽 杨树不同种类生根的难易程度有极大差异。生根用基本的培养基多为1/2MS培养基，生长调节剂多用IBA或IAA、NAA。细胞分裂素对根的生成有抑制作用，但若将分化培养基中诱导出的不定芽直接转入生根培养基中，可能由于细胞分裂素不足，导致芽苗发黄枯死，宜采用逐

4、步降低细胞分裂素的过渡培养法。移栽时把有根的完整植株取出，洗去根部附着的培养基，覆盖并保持一定的湿度与光照，一段时间后移入温室，最后定植在造林地。（二）杨树胚胎培养1.培养程序 取不同发育时期的蒴果经表面消毒后，在无菌超净工作台上解剖，剥离幼胚或胚珠接种于培养基上，使胚在体外继续发育，最终萌发成苗。2.影响因素 胚培养时期是影响离体胚培养成功的关键因素。（三）杨树花药和花粉培养1.培养程序 冬末早春时期，从生长健壮的雄株上采取花枝，室内水培催芽，待花芽膨大后，摘下花芽，剥掉芽鳞和苞片，浸入10%次氯酸钠溶液中消毒10min，无菌水冲洗，在超净工作台上剥离花药，接种于培养基上，2527黑暗下培养

5、，诱导愈伤组织。待愈伤组织长到直径3mm时，转移到分化培养基上，23/16昼夜温差89h/d光照，诱导愈伤组织再分化成苗。2.影响因素花药离体接种后，诱导形成的愈伤组织在时间和质地上有较大差异。接种20d后出现的紧密型愈伤组织大多为花粉愈伤组织；越接近自然花期（五月份）采枝，且取花粉处于单核靠边期的花药离体培养，花药愈伤组织诱导率越高，适当预处理（如低温），可明显提高花药愈伤组织诱导。培养基及其附加物也影响花粉愈伤组织的诱导和分化。二、杨树原生质体培养 原生质体分离受多种因素影响，如酶制剂组合、酶解温度和时间等，如以新疆杨无菌苗叶片为材料，筛选出适宜的原生质体游离条件为：CPW+KM8p+3%

6、纤维素酶R-10+0.5%1.5%离析酶R-10+0.5%半纤维素酶+0.1%0.5%果胶酶Y-23，+0.6mol/L甘露醇，酶解温度27，酶解时间8h,采用蔗糖等密度离心纯化，获得原生质体产量达1.57 107 个/g，有活力原生质体占79.41%。杨树原生质体培养多采用富含有机成分的KM8p和V-KM培养基，培养方法多为液体浅层培养，密度为5 103 2.5 105/mL。目前，杨树原生质体再生植株大多是通过愈伤组织器官分化途径获得的。三、杨树遗传转化（一）杨树农杆菌介导转化法 目前，杨树的遗传转化主要有农杆菌介导法和DNA直接导入法，农杆菌介导法最为常用。农杆菌介导法多使用胭脂碱型菌株C18或是章鱼碱型菌株LBA4404；浸染时间一般为1060min；预培养以及转化中附加一定的酚类物质，如AS（乙酰丁香酮）和OH-AS（羧基乙酰丁香酮），能有效提高转化效率。（二）杨树遗传转化的应用 （1）抗虫基因工程；（2）抗病基因工程；（3）抗病毒基因；（4）抗非生物胁迫；（5）品质改良。