培养细胞的细胞生物学.ppt

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1、生物学特点生物学特点体外培养物的细胞生物学特点体外培养物的细胞生物学特点总的：总的：与体内仍有相似与体内仍有相似-体外培养的细胞体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系细胞和基质的相互关系但有不同但有不同 相对相对孤立孤立、相对单一、相对单一 失去原有组织结构和细胞形态失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显分化减弱或不显 体外培养物的细胞生物学特点体外培养物的细胞生物学特点 与体内仍有相似与体内仍有相似-体外培养的细胞体外培养的细胞 仍存在仍存在细胞和细胞细胞和细胞、细胞和基质细胞和基质 的的相互关系相互关系 体外培养体外培养 单个细胞也能生存和增殖单个细胞也

2、能生存和增殖 但但单个细胞不是细胞永久存在单个细胞不是细胞永久存在的形式的形式,培养的培养的细胞之间细胞之间仍有在仍有在形态形态和和机能上机能上的的 相互依存关系相互依存关系 1.培养的培养的细胞之间细胞之间 仍有在形态和机能上的仍有在形态和机能上的相互依存关系相互依存关系。在在结构上结构上，如：，如：上皮细胞仍见有桥粒上皮细胞仍见有桥粒 在在生理活动上生理活动上，单个细胞虽能生长繁殖单个细胞虽能生长繁殖,但但不如群体细胞能力强不如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止当相邻细胞接触，便导致运动停止 细胞相互沟通生物信息细胞相互沟通生物信息的结果的结果 2.培养的细胞和培养的细胞和基质

3、之间基质之间 对细胞外基质仍有依存性对细胞外基质仍有依存性 但有不同但有不同 人工所模拟的条件人工所模拟的条件与与体内体内实际情况实际情况 仍仍不完全不完全 相同相同 当细胞被置于当细胞被置于体外培养体外培养后后 久了久了,必然必然发生变化发生变化与体内主要不同与体内主要不同 相对相对孤立孤立、相对单一、相对单一 缺乏体内的缺乏体内的一些一些影响影响 主要表现主要表现 失去原有组织结构和细胞形态失去原有组织结构和细胞形态 如：肌肉细胞如：肌肉细胞纤维化纤维化 分化减弱或不显分化减弱或不显 出现类似出现类似“返祖返祖”现象：细胞趋向单一化现象：细胞趋向单一化 或获得不死性或获得不死性 或变成具有

4、恶性性状的细胞群或变成具有恶性性状的细胞群 因此因此要正确认识要正确认识体外培养细胞体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体是一种特定条件下生长的细胞群体培养细胞培养细胞的主要的生物学特点 1.去分化去分化2.贴壁和铺展贴壁和铺展3.接触抑制接触抑制和和密度依赖性密度依赖性去分化去分化 体外培养物的细胞生物学特点体外培养物的细胞生物学特点 体外培养生长生物学特征具有体外培养生长生物学特征具有两重性两重性 基本生物学特征基本生物学特征 仍仍与体内的细胞相似与体内的细胞相似 培养物培养物在体外在体外条件下生长，条件下生长，许多生长生物学行为许多生长生物学行为发生改变发生改变 培养细胞分化状态的

5、变化培养细胞分化状态的变化 体内体内细胞细胞-三方面三方面的影响与调节的影响与调节:体外环境体外环境的影响的影响 体内神经体内神经体液因素体液因素 的调节的调节 细胞与局部微环境细胞与局部微环境的相互作用的相互作用 控制控制-维持着细胞的维持着细胞的分化特征分化特征。体外体外培养时，培养时，失去了失去了-分化特征分化特征逐渐逐渐减弱减弱 去分化去分化(脱分化):各种分化细胞，逐渐各种分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能失去各自的形态与功能“个性个性”，表现出某，表现出某种种趋同性趋同性 如如:培养的培养的成纤维细胞成纤维细胞 在在适当刺激适当刺激下，可下，可分化分化为为 其它结缔组织细胞其它结缔

6、组织细胞和和肌组织细胞肌组织细胞，表现出表现出类似未分化类似未分化的间充质细胞的特性，的间充质细胞的特性，返祖返祖 有有2点点 1.但但,去分化去分化并不并不意味着意味着完全返回完全返回胚胎时期的原始细胞状态胚胎时期的原始细胞状态如如:高度分化高度分化的的神经细胞神经细胞和和心肌细胞心肌细胞 已经丧失的已经丧失的增生活性不可能恢复增生活性不可能恢复 但已经具备的但已经具备的生物电活动特性生物电活动特性 不会完全失去不会完全失去 2.可可重新表现重新表现出出分化特点分化特点 如：如：把把表皮细胞表皮细胞放在放在气液界面上气液界面上培养，可培养，可分化分化成成 含大量角蛋白丝的含大量角蛋白丝的角质

7、细胞角质细胞 内皮细胞内皮细胞-但，这种但，这种能力能力会会随着培养时间延长随着培养时间延长 逐渐丧失逐渐丧失总之，休外培养总之，休外培养,使细胞使细胞 结构结构与与功能上功能上的的“可塑性可塑性”增大增大 防止去分化防止去分化贴贴附和铺展附和铺展贴附贴附(粘附粘附)和附着和附着 粘附粘附于固相表面是锚定依赖性细胞于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求生命活动的基本要求细胞被接种到培养器皿内以后细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生粘附首先要发生粘附(adherence)，是细胞培养以后能否成功的第一步是细胞培养以后能否成功的第一步.细胞悬液后细胞悬液后 耽搁得越久，越容易发生退化耽搁得越

8、久，越容易发生退化提供什么样的提供什么样的生长表面生长表面 是是细胞能否成功粘附的主要因素细胞能否成功粘附的主要因素。不同细胞不同细胞的的粘附能力不同粘附能力不同 如如巨噬细胞、成纤维细胞巨噬细胞、成纤维细胞等等粘附能力强粘附能力强 能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面 如如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱 需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面 粘附能力强的细胞粘附能力强的细胞-粘附能力弱的细胞粘附能力弱的细胞-可可利用利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱）此特点（粘附：快、牢；慢、

9、弱）分离分离、纯化细胞纯化细胞 细胞形态细胞形态因因是否贴附于底物是否贴附于底物而而不同不同悬浮悬浮的细胞的细胞:基本基本圆形圆形粘附粘附和贴壁的细胞和贴壁的细胞:扁平圆形扁平圆形 相差显微镜相差显微镜 “亮圈亮圈”很快很快过渡过渡-贴附过程贴附过程：3步步贴附因子粘附贴附因子粘附细胞开始附着细胞开始附着细胞进一步细胞进一步牢固附着牢固附着伸伸展展影响因素影响因素 各种细胞不同各种细胞不同 如接种如接种30后后第二瓶第二瓶30 (附着最强附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞巨噬细胞一成纤维细胞 上皮细胞上皮细胞血细胞血细胞(最弱最弱)生物因素生物因素 血清、培养液中的促附着因子血清、培养液中的促附着

10、因子 机械机械，物理等物理等其他因素因素其他因素因素 离心：促进附着离心：促进附着 流动：培养液流动可阻止细胞附着流动：培养液流动可阻止细胞附着 低温：可抑制附着低温：可抑制附着措施措施（因素）（因素）1.包被包被对对分化程度高、生长能力差分化程度高、生长能力差的细胞的细胞 可在可在培养瓶皿表面包被培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和有利于细胞粘附和 生长的生长的生物活性物质生物活性物质 如如:-通过其所带电荷先吸附通过其所带电荷先吸附-,培养的细胞再与其结培养的细胞再与其结合。合。血清内血清内含有多种能够含有多种能够 促进细胞粘附促进细胞粘附的的成分成分 细胞细胞本身也可能本身也可能产生产生一些

11、一些粘附分子粘附分子 措施措施2.减少接种减少接种时细胞悬液的时细胞悬液的量量待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液3.减少减少培养液中培养液中血清的含量血清的含量 使培养液使培养液黏度降低黏度降低4.培养液中培养液中离子成分及其浓度离子成分及其浓度 如，培养液中的如，培养液中的Ca含量过低时不利于含量过低时不利于 细胞的粘附、贴壁和铺展细胞的粘附、贴壁和铺展5.培养液的温度培养液的温度 低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁 促进细胞粘附的成分促进细胞粘附的成分铺展铺展 铺展铺展（伸展）（伸展）(spread)进行进

12、行生命活动生命活动的一种的一种基本的生长特点基本的生长特点或生长行为或生长行为 铺展状况制约铺展状况制约细胞的细胞的分裂增殖分裂增殖活动活动过程过程，细胞先由圆形变为，细胞先由圆形变为 圆饼形圆饼形(放射状铺展细胞放射状铺展细胞)逐渐铺开伸展成为扁平的极性细胞逐渐铺开伸展成为扁平的极性细胞 极性细胞极性细胞就是各种有机体细胞就是各种有机体细胞 在体外在体外的的特征性特征性 细胞形态细胞形态铺展状况铺展状况 是调节细胞形状的主要方面是调节细胞形状的主要方面 铺展得越好，细胞越扁铺展得越好，细胞越扁 意味着细胞与生长基质表面接触面越大意味着细胞与生长基质表面接触面越大铺展状况铺展状况 与与细胞的生

13、长细胞的生长有密切关系有密切关系 只有当只有当细胞铺展细胞铺展到到合适合适的的程度程度 DNA合成合成才开始才开始进行进行 通过比较贴壁依赖性细胞通过比较贴壁依赖性细胞 不同铺展程度与不同铺展程度与DNA合成率之间的关系合成率之间的关系 发现发现细胞越扁细胞越扁(厚度越小厚度越小)DNA合成率越高合成率越高 细胞形状细胞形状(伸展伸展)与细胞的生长与细胞的生长 合适的合适的细胞细胞形状形状-伸展伸展 对正常细胞的对正常细胞的DNA合成合成重要重要 对其对其生长生长重要重要 伸展的意义伸展的意义实验一实验一 成纤维细胞成纤维细胞1.附着附着于玻璃或塑料底物于玻璃或塑料底物:细胞增殖细胞增殖2.悬

14、浮悬浮培养培养:细胞细胞不增殖不增殖3.a.培养在培养在悬浮的玻璃纤维悬浮的玻璃纤维上上:若若够长够长:细胞可细胞可增殖增殖 若若短短于于20um,细胞可附着细胞可附着,但增殖很慢但增殖很慢 或或不增殖不增殖 b.在在某些塑料某些塑料上上:有些细胞可附着有些细胞可附着,但但增殖很慢增殖很慢或不增殖或不增殖 伸展的意义伸展的意义原因原因分析分析在在1.附着附着培养物上培养物上:细胞很扁平细胞很扁平,很伸展很伸展在在2.悬浮悬浮培养中培养中:细胞圆球形细胞圆球形,未伸展未伸展在在3.培养培养中中:细胞维持介于细胞维持介于扁平与圆球之间扁平与圆球之间因此因此,细胞形状细胞形状,至关重要至关重要伸展伸

15、展至至原来的形态原来的形态,才能才能增殖增殖 伸展的意义伸展的意义-实验伸展的意义伸展的意义-实验二实验二 PolyHEMA 35-0.0035 um 高浓度（厚）高浓度（厚）低浓度低浓度（薄）（薄）细胞细胞 圆圆 扁扁 （附着最差）（附着最差）获得细胞构型（模型）获得细胞构型（模型）不同伸展程度的细胞不同伸展程度的细胞PolyHEMA 细胞细胞厚厚 厚厚（2122 um）（伸展差伸展差）（10+-2）薄薄 薄薄（2 um）（伸展好伸展好）（46+-13）PolyHEMA Cell Height(um)H3 (C.P.M).1.00 22 7+-5 4 x 10-2 15 50+-5 4 x

16、10-3 6 250+-15 细胞细胞悬浮悬浮在培养液中时，近似在培养液中时，近似球体球体形状形状 当当接触坚硬平面接触坚硬平面 即即铺展于底物上铺展于底物上，扁平状扁平状 与底物形成很多接触点与底物形成很多接触点 伸展过程伸展过程(1)开始开始阶段阶段 开始附着铺开开始附着铺开 细胞细胞附着于底物附着于底物 球形的细胞，下方表面与底物接触成扁球形的细胞，下方表面与底物接触成扁 但尚未形成新的伪足但尚未形成新的伪足 伸展分几个阶段伸展分几个阶段(2)放射状铺展放射状铺展阶段阶段在球形细胞体的在球形细胞体的周围周围形成很多形成很多伪足隆起伪足隆起伪足形状伪足形状 主要主要 柱形丝状柱形丝状:直径

17、直径0.2-0.5um 长长10-20 扁平片状扁平片状:厚厚0.1-0.5 宽宽2-5 尚有尚有:小泡状叶状小泡状叶状:直径直径1-2 开始开始时时:絲状多絲状多 以后以后 片状增加片状增加 许多许多伪足伪足 形成薄的形成薄的胞质小片牢固贴于底物胞质小片牢固贴于底物 胞体胞体中央部分中央部分 扁扁 整亇整亇细胞扁平细胞扁平(3)极化阶段极化阶段细胞细胞最后最后伸展伸展附着的情况附着的情况 实验：用多种细胞，实验：用多种细胞，以显微操作及缩时电影以显微操作及缩时电影 定位细胞附着于玻璃和聚苯乙烯情况定位细胞附着于玻璃和聚苯乙烯情况 检测检测-显微针头显微针头 结果：附着结果：附着规律规律附着点

18、附着点：附着附着规律规律几乎几乎未见于细胞的中央区未见于细胞的中央区 (如不在核之下如不在核之下)总在边缘总在边缘，边缘边缘”摆动摆动”活动的部位活动的部位 凸的边缘凸的边缘 在薄的边缘在薄的边缘 附着区：附着区：约为约为细胞下面表面细胞下面表面的的15-35附着、伸展的条件附着、伸展的条件底物底物 细胞能在很多固体表面附着细胞能在很多固体表面附着 最终铺展的程度，取决于底物的性质最终铺展的程度，取决于底物的性质影响因素影响因素：活性物质活性物质(贴附贴附、伸展因子伸展因子):血清、培养液中，血清、培养液中，或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附

19、后可利于细胞的铺展 细胞借助这些分子细胞借助这些分子,可附着于各种可附着于各种”非特异性非特异性”的底物上的底物上 如如Fn，胶原，聚赖氨酸胶原，聚赖氨酸 机械机械，物理因素物理因素 接触抑制接触抑制和和密度依赖性密度依赖性接触抑制接触抑制和密度依赖性生长仰制密度依赖性生长仰制 运动的接触抑制运动的接触抑制密度依赖性生长仰制密度依赖性生长仰制增殖的密度抑制增殖的密度抑制实验实验方方法法：3T3细细胞胞，接接种种105于于6cm培培养养皿皿，5d细胞计数细胞计数 于于加加入入10、20、30牛牛血血清清的的 培养液中，培养液中，结果结果：增殖的密度抑制增殖的密度抑制结果结果：10血清：血清：20

20、hr后后铺满铺满(汇合汇合confluent)以后至以后至5d 细胞数不再增加细胞数不再增加 (细胞细胞 数约数约1066cm皿皿)密度抑制密度抑制 30%血清：血清：以后经常换液至以后经常换液至5d，细胞细胞密度继续增加密度继续增加 (可达可达6xl066cm皿皿)说明说明:密度抑制密度抑制-铺满后铺满后 不再增殖不再增殖(分裂停止分裂停止)血清血清可可降低密度抑制降低密度抑制 只加入于只加入于3T3停止生停止生 长的培养液长的培养液中中 细胞不生长细胞不生长 当再加入当再加入血清血清 细胞细胞又又生长生长说明说明血清血清可可消除密度抑制消除密度抑制(2)转化细胞的密度抑制降低转化细胞的密度

21、抑制降低 用用此培养液此培养液 3 3T3T3细胞细胞不再分裂增殖不再分裂增殖 当再加入当再加入1010血清，血清，3 3T3T3细胞可再增殖细胞可再增殖 表示血清可消除密度抑制表示血清可消除密度抑制 但当用但当用此培养液此培养液，于于转化的转化的3T3细胞细胞(SV3T3)却却生长良好生长良好 表示表示转化细胞密度抑制降低转化细胞密度抑制降低 (血清需要降低血清需要降低)说明：说明：转化细胞转化细胞的的密度抑制降低密度抑制降低.可可生长生长至至较高的密度较高的密度总的说明：总的说明：细胞生长细胞生长有有密度抑制密度抑制血清血清可可降低密度抑制降低密度抑制转化细胞转化细胞可可降低密度抑制降低密度抑制