广藿香PTS及FPS基因启动子结合蛋白初步筛选 胡莹.docx

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1、广州中医药大学中药学院2019届本科毕业论文广藿香PTS及FPS基因启动子结合蛋白初步筛选作者：胡莹（2015级中药学专业 2015031089）指导教师：陈立凯（广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心）【摘要】目的：初步筛选广藿香醇生物合成PatPTS及PatFPPS启动子结合蛋白及酶互作蛋白 方法：对基因PatPTS及FPPS进行qRT-PCR分析转录差异，利用DNA Pulldown实验技术，得到DNA结合转录调控蛋白质，寻找与启动子结合的蛋白，并通过酵母单杂技术对结合蛋白进一步验证 结果：筛选出广藿香9592 basic helix-loop-helix transcription

2、factor（9592bHLH）和zinc finger BED domain-containing protein RICESLEEPER 2-like（BED-R）可能与PTS启动子有结合活性 结论：对于广藿香醇生物合成PTS及FPS基因启动子结合蛋白的初步筛选，获得了两种可能与PTS启动子有结合活性的蛋白，有利于揭示响应外源激素MeJA诱导的广藿香醇代谢与表达调控机理，进一步认识广藿香药效成分萜类化合物的合成及调控机制【关键词】广藿香；萜类生物合成；PatPTS；PatFPPS；DNA PulldownPreliminary Screening of Promoter Binding P

3、roteins of PTS and FPS Genes in Pogostemon cablinGraduate: Hu YingSupervisor: Chen Likai【Abstract】Objective To screen the patchy protein and enzyme interaction protein of patchocarpol biosynthesis PatPTS and PatFPPS promoter. Methods The transcriptional differences between the genes PatPTS and FPPS

4、were analyzed by qRT-PCR. DNA pulldown assay was used to obtain DNA-binding transcriptional regulatory proteins, and the proteins bound to the promoter were searched. The binding proteins were further verified by yeast single hybrid technology. Results Screening out of the musk scent 9592 basic heli

5、x-loop-helix transcription factor (9592bHLH) and zinc finger BED domain-containing protein RICESLEEPER 2-like (BED-R) may have binding activity to the PTS promoter. Conclusion For the preliminary screening of the promoter protein of PTS and FPS gene in patchouli alcohol biosynthesis, two proteins wh

6、ich may bind to the PTS promoter were obtained, which was helpful to reveal the metabolism and expression of patchouli alcohol induced by exogenous hormone MeJA. Regulating mechanism, further understanding the synthesis and regulation mechanism of quinone compounds in patchouli.【Keywords】Potostemon

7、cablin; Terpenoid biosynthesis; PatPTS; PatFPPS; DNA Pulldown前言广藿香 Pogostemon cablin(Blanco) Benth. 为唇形科刺蕊草属植物，是广东的道地药材，具有芳香化浊，开胃止呕，发表解暑的功效1。广藿香所富含的挥发油中含有丰富的挥发性萜类，主要由单萜、倍半萜及其衍生物组成，含量较大的有广藿香醇、广藿香酮、反式-丁香烯等成分2-3，其中占广藿香油含量60%以上的广藿香醇、广藿香酮4-5被研究证明为广藿香发挥药效的主要有效成分6。广藿香醇含量最高，属三环倍半萜化合物，具有抗菌抗炎等作用，因此研究广藿香倍半萜类化合

8、物生物合成的分子机制，有利于调控广藿香油特别是广藿香醇成分的快速合成和大量累积，对广藿香药用资源的应用、保护和发展具有重要的意义。本课题创新利用DNA Pull-down-MS技术筛选获得与萜类生物合成MVA途径的下游关键酶萜类合酶PatPTS和PatFPPS启动子基因相结合的蛋白，藉此了解其转录方式和受什么转录因子的调控，以更好的调控广藿香醇的生物合成，为萜类代谢通路的明晰添砖加瓦。概述1 萜类生物合成1.1 萜类生物合成途径萜类化合物是一类具有抗癌、抗过敏等多种生物活性的天然产物，是由甲戊二羟酸衍生而来的化合物，其种类繁多，以异戊二烯为结构单元，按照其单元数量的不同可分为单萜、倍半萜、二萜

9、等。大量研究表明，萜类有两条生物合成途径，其一为位于细胞质中的甲戊二羟酸途径（mevalonate pathway，MVA），另一则是位于质体中的脱氧木酮糖-5-磷酸途径（1-deoxy-D-xylulose-5-phpsphate-pathway，DXP）或甲基赤藓醇-4-磷酸途径（methylerythritol-4-phosphate pathway，MEP）。MVP途径是以乙酰辅酶A为原料,经甲戊二羟酸形成异戊烯基焦磷酸酯 (IPP)及其双键异构体二甲基烯丙基焦磷酸酯 (DMAPP)，进一步缩合形成倍半萜、三萜和甾体，而DXP途径则是以丙酮酸和磷酸甘油醛为原料，在转酮酶的催化作用下聚合

10、DXP，经异构化和还原等反应，形成MEP中间体，再经磷酸化、环化等步骤生成IPP，从而衍生单萜、二萜等萜类化合物7。图1 倍半萜类生物合成途径1.2 PTS及FPS广藿香醇合成酶( Patchoulol synthase，PTS) 是广藿香醇形成过程中的一个限速酶，可催化倍半萜前体法尼基焦磷酸（Farnesyl diphosphate，FDP）转化形成包括广藿香醇在内的多达14种不同的倍半萜化合物,是调控广藿香醇生物合成的关键所在8。PTS具有强大的生物催化潜力，Frister等9发现重组的PTS蛋白酶除了能转化常规的E，E-FDP形成以广藿香醇为主的倍半萜产物，还能转化 2Z，6EFDP、2

11、E，6Z-FDP 等 FDP的同分异构体形成不同的倍半萜产物。刘信丹10对广藿香合成酶的研究成功克隆出其基因的全长cDNA序列，构建并表达PTS基因的原核表达载体。另有研究发现广藿香醇合酶基因受到mi156靶向SPL转录因子的调控，过表达AtrSPL10则使PatPTS表达多倍提高，倍半萜含量约提高20%，揭示AtmiR156通过靶向SPLs调控PatPTS基因的转录水平进而控制广藿香中倍半萜成分的合成11，随着SPL水平的提高，PTS基因的表达也相应提高，进而提高广藿香醇的含量,但是其具体的转录调节机制，分子调控网络未解析透彻。法尼基焦磷酸酶（FPPS）是MVA途径的下游关键酶12-13。F

12、PPS在植物中以同源二聚体的形式存在，催化2个异戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）分子和1个二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）分子生成法呢基二磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）14-15，FPP是甾醇、皂苷、多萜醇、泛醌等倍半萜和三萜类化合物的合成前体，广泛参与植物的初生代谢和次生代谢。有研究表明，过量表达青蒿的FPPS基因可以使转基因青蒿株系中的青蒿素量有一定的提高，在人参发根中过量表达FPPS可以提高人参总皂苷的量16-17。说明可通过调控植物FPPS基因的过量表达去提高植物

13、有效活性成分的产量，以此提高植物的品质18。FPPS及TPS是合成广藿香醇的下游关键酶基因。FPPS催化生成FPP，FPP又作为底物，被PTS催化生成萜类化合物广藿香醇，是细胞质体内广藿香醇合成代谢中的重要调控位点。研究PTS及FPPS对明确广藿香醇的生物合成具有重要意义。2 茉莉酸甲酯对植物萜类化合物的调控茉莉酸(JA)及其衍生物统称为茉莉素(JAs),是广泛存在于植物中的一类具有环戊酮结构的化合物，由亚麻酸经脂肪氧合酶途径合成的植物内源激素19, 是植物伤害反应的信号分子，主要包括茉莉酸异亮氨酸( jasmonic acid-isoleucine，JA-Ile) 、茉莉酸( jasmoni

14、c acid，JA) 和茉莉酸甲酯( methyl-jasmonic acid，MeJA) 等，对植物生长和发育具有广泛的生理效应；同时可作为内源信号分子参与植物的抗逆反应。长期以来,对JA信号途径的机制及功能的研究一直是生命科学研究的热点之一。植物萜类化合物大多为次生代谢物，而植物次生代谢产物的合成受相应转录因子调节，转录因子能响应上游转导信号的激活。当植物受外界刺激发生应激反应时，MeJA能充当信号转导，且具有挥发性、不易被离子化、易透过细胞20等特点。通过MeJA信号转导，可以激活或抑制相应的转录因子，转录因子作用影响下游基因的转录，从而调控参与植物次生代谢的相关基因的表达，对次生代谢产

15、物的生物合成进行调控21，MeJA的信号转导通路见图2。图2 MeJA的信号通路转导简图在植物受到外界刺激时生成的JA-Ile会与细胞内的茉莉酸信号受体COI1和JAZ蛋白相结合形成复合物，被转移到26s蛋白酶体内降解，释放与JAZ蛋白结合的MYC、MYB、NAC、WRKY等转录因子，从而启动下游受茉莉酸诱导基因的表达来调控一系列的细胞生命活动22。 茉莉酸甲酯的应用能调控萜类生物合成并且提高其产量，任昂等研究发现茉莉酸甲酯能显著提高灵芝三萜含量并上调灵芝三萜生物合成途径中的羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、法尼酯焦磷酸合成酶和羊毛甾醇合成酶等基因的表达23。张文娟使用MeJA按照时间梯度与浓度梯度诱

16、导大戟愈伤组织后的萜类代谢途径3个关键酶基因（HMGR、SQS、FPS）的相对表达量与总三萜含量都叫较对照组有所增加24。近年MeJA已经广泛地用于调控植物萜类化合物的合成，与之响应的转录因子在青蒿素、红豆杉、阳春砂、罗汉果、苦玄参和三七等大多数植物中皆存在。 本研究引入茉莉酸甲酯诱导处理广藿香并设置对照组，以便更好地研究PatPTS及PatFPPS基因启动子结合蛋白。3 转录因子的研究方法3.1 实时荧光PCR技术实时荧光定量PCR( real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT -qPCR)是通过对PCR扩增

17、反应中每个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板的定量及定性分析25，原理是在PCR体系中加入荧光染料或荧光分子标记的寡核苷酸链，与PCR扩增产物结合时荧光分子在紫外线的激发下发出荧光，通过荧光信号探测器直接检测反应体系中荧光信号的变化，来监测目的基因的拷贝数量，并据此推断目的基因的初始量26，具有特异性强、灵敏度高、自动化、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，被广泛运用在分子生物学实验中。例如Mason27等利用TaqMAN探针荧光定量 PCR 技术检测转基因番茄的目的基因的拷贝数。俞滢以茉莉花 Actin 基因为内参，采用RT-qPCR技术，对茉莉花开放过程中不同时期JsTPS基

18、因的表达量进行测定与分析28。3.2 DNA Pulldown技术DNA Pulldown是一种获取DNA结合转录调控蛋白质实验技术。针对目标区域设计特异性DNA probe，并经过脱硫生物素标记；细胞核提取物与DNA probe孵育，作用特异性转录调控蛋白质可以和DNA probe结合；经链霉亲和素偶联magnetic beads亲和结合，及洗涤去除非特异性结合蛋白分子；最后，洗脱获得具备转录调控功能的蛋白质；所获得的蛋白质，可以开展western blot或质谱鉴定获得结合强度及蛋白质类型。生物素与链亲和素结合速度快、灵敏度高、特异性强，所形成的复合物非常稳定，并且具有信号放大作用，一个链

19、亲和素可以连接4个生物素，提高杂交容量,而磁珠分离技术重复性好、结合效率高、操作方便，使得这一系统在鉴定DNA-蛋白质相互作用方面表现出特有的优势。利用磁珠分离技术，可筛选得到肺组织细胞核中与HMGB1启动子结合的差异蛋白29。通过观察差异条带，分析显示，与正常对照组比较，VI-LI大鼠组有10个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有6个蛋白的结合力减弱30。利用生物素链亲和素磁珠系统，分离 HMGB1启动子-蛋白复合物，得到对照组和SAP组共有14条差异条带，质谱鉴定这些差异条带得到H2A、H2B、H3、H4、S100A9转录相关蛋白，对于下一步研究HMGB1在SAP肝损伤过程中的转录调控机

20、制具有重要意义。3.3 酵母单杂交技术酵母单杂交技术(veast one hybrid)是一种体外分析DNA与蛋白质相互作用的技术，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因或对DNA结合位点进行分析，其理论基础是：真核生物的转录起始需要转录因子的参与，而通常这些转录激活因子具有2个功能上独立的结构域DNA结合结构域（DNA-binding domain BD）和DNA激活结构域（Activation domain AD），前者特异结合于顺式作用元件上，后者实施基因表达调控功能31-32，因此DNA结合结构域和DNA激活结构域可以分开使用，单独的结合结

21、构域或转录激活结构域都不能启动下游报道基因的表达。酵母单杂交技术利用此原理构建各种基因与转录激活域融合的融合蛋白，只要转录激活域所融合的蛋白能与特异的DNA序列结合，即说明它能够起到转录因子结合结构域的功能，即此形成有功能的转录因子，从而实施基因表达调控，激活启动子下游报道基因的表达。用于酵母单杂交系统的酵母GAL4 蛋白即是一种典型的转录因子33。利用酵母单杂交技术已经识别并鉴定出了许多与目的DNA片段相结合的蛋白质34。2015年，Deokar等35利用酵母单杂技术筛选出了与鹰嘴豆非生物胁迫相关的转录因子 CarEF116。研究部分本研究利用MeJA激素处理广藿香幼苗，通过GC-MS分析代

22、谢成分含量，qRT-PCR分析差异表达，Pull-down-MS技术寻找互作蛋白，并且探讨了目标蛋白质对PatPTS及FPPS的作用机制和调控方式、转录相关调控因子研究，从而揭示响应外源激素诱导的广藿香醇代谢与表达调控机理，进一步认识广藿香药效成分萜类化合物的合成及调控机制。1 实验内容1.茉莉酸甲酯处理广藿香幼苗，设置对照组2.用PCR技术大量扩增PatPTS和PatFPPS启动子序列，切胶回收得到生物素探针序列。 3.利用DNA Pull-down MS 钓取广藿香核蛋白提取物中的结合蛋白。钓取的结合蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳，用质谱快速染色试剂盒染色，胶内消化回收蛋白并通过LC-MS

23、测定蛋白。2 实验仪器与材料2.1 仪器与材料植物细胞核及核蛋白分离试剂盒（西安赫特生物科技有限公司）；MilliQ 15 mL 3 kD蛋白浓缩柱；Taq DNA聚合酶（南京诺唯赞生物科技有限公司）；DNA Marker（日本Takara公司）；鲑鱼精DNA；琼脂糖；GEL/PCR Purification Mini Kit（Favorgen公司）；MACS Streptavidin Kit（德国miltenyibiotec公司）；Milli-Q water、 10 l and 200 l tips（eppendorf）、乙腈 Acetonitrile(Fisher A/0626/17)、甲

24、醇 methanol（Fisher）、硫代硫酸钠5H2O Sodium thiosulfate pentahydrate（Sigma德国）、二硫苏糖醇 Dithiothreitol （PlusOne）、碘乙酰胺 Iodoacetamide（Sigma德国）、胰酶 Trypsin (PromegaV5280)、胰酶重溶液 Trypsin resolve olution(Promega V530) PCR仪，电泳仪，考染仪，大型冷冻离心机，Q Exactive mass spectrometer (Thermo fisher)质谱仪，真空干燥仪、水浴锅、低温冷冻离心机。2.2 样品材料使用浓度为3

25、00M/L的茉莉酸甲酯对广藿香幼苗进行处理，作为MeJA组，酒精作为CK对照组，对其叶片表面进行喷湿处理，8小时后，用纯水冲洗表面杂质，擦干，由叶柄处剪取叶片，液氮冻存备用。3 实验方法与条件3.1 DNA Pulldown实验筛选核蛋白的提取取液氮将约10 g组织研磨充分，加入1*核分离缓冲液30 mL，玻璃匀浆器研磨，300目过滤网过滤，取滤液，5000 rpm离心10 min，取沉淀；将沉淀用1*核分离缓冲液（含1%蛋白酶抑制剂）重悬洗涤，洗涤转速为1000 g离心5 min离心，重复洗涤2次，12000 g离心5 min，取沉淀；临用前抽提工作液加入DTT（5 mM），蛋白酶抑制剂（1

26、%），并4，8000 rpm离心20 min，12000 g离心10 min，上清液转移至离心管，用MilliQ 15 mL 3 kD蛋白浓缩柱对上清液浓缩和清除盐，取上清至- 81保存备用。3.2 生物素探针的制备分别设计PatPTS及PatFPPS启动子基因的链生物素探针，并利用课题组前期得到的PatPTS及PatFPPS启动子基因PCR扩增，凝胶电泳分别得到1659 bp的PatPTS探针及724bp的PatFPPS探针，利用GEL/PCR Purification Mini Kit回收探针，于-20保存备用。基因名称正反引物链生物素引物PatPTS（840bp）Primer1LeftB

27、iotin-TCATCATCTTGGACCGTCCTTGPrimer1RightBiotin-GCTAGCTCGACTGTGACTGTTTPatFPPS（724bp）Primer1LeftBiotin-TCATCATCTTGGACCGTCCTTGPrimer1RightBiotin-GCTAGCTCGACTGTGACTGTTT 3.3 PatPTS及PatFPPS DNA pulldown分析利用Bradford定量方法进行定量，将0、1、2、3、4、5、6 L的牛血清白蛋白(BSA)标准溶液（1 mg/ml）和适当体积的样品分别加入到酶标板中， PBS缓冲液补足至15 L后混匀。向各试管中加

28、入285 L考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置5分钟，用酶标仪测量595nm下的吸光度，读出每个样品的吸收率。绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。取CK组及MeJA组核蛋白提取物各1.25mg/组，按下表及操作分别加入其余组分。表 DNA pulldown 反应加入试剂及加入量加入物加入量备注COX-2探针50 pmolTPS（28 g）/FPP（24 g）核提取物1250 g（浓缩至3-10 g/l）终浓度1 g/l磁珠100 l鲑鱼精DNA5 Lcocktail10 Lbindingbuffer（x）bindingEnhancer（x/100）2倍核提取物体积（1）将PatPTS及PatFPP

29、S生物素探针与核蛋白提取液在冰上孵育60分钟，再加入100L链亲和素磁珠，混合均匀。（2）将分离柱置于分离器上，加入100L appropriate Equilibration Buffer清洗。（3）用100L ddH2O清洗分离柱，重复两次。（4）加入链亲和素磁珠-生物素探针-结合蛋白复合物到柱子中。（5）用100L的washing buffer清洗杂蛋白，重复四次。（6）加入150L appropriate Equilibration Buffer洗脱目标蛋白与生物素探针结合物3.4 SDS-PAGE凝胶电泳，考染及回收将DNA pulldown的appropriate Equilibr

30、ation Buffer洗脱液分别进行10%SDS-PAGE凝胶电泳。并用考马斯亮蓝染色，置4ddH2O保存。将胶条切下，进行MALDI-TOF质谱鉴定。3.5 蛋白酶解1. 切胶: 将蛋白条带切出后放入 0.6 ml EP 管中。2. 水洗: ：每管加入120-150ul MilliQ 水，置于震荡器震荡 1min,吸出液体。每管再加入 120-150ulMilliQ 水,置于震荡器震荡 1min，吸出液体的同时用枪头把胶粒切成 1mm3 大小。3. 脱色：加脱色液 50ul 于 EP 管中，置于白色滤纸上观察，颜色完全脱去后马上吸出液体， 然后加 150ul 水冲洗停止反应，吹打洗涤胶粒，

31、吸出液体后再加入 150ul ddH2O 洗胶粒两次。4. 脱水：每管加入 150ul 100% ACN ，震荡 30s 等胶粒变白后吸出液体。5. 还原：往干燥胶粒中加入 120ul 25 mM DTT，吸涨后放 55孵育 50min。6. 水洗：吸出 DTT，加入 150ul 水吹打水洗胶粒 3 次。7. 脱水：150l 100% ACN 脱水至胶粒变白。8. 酶切：用覆盖液稀释胰酶至 10ng/l；每管胶粒加入胰酶 10l，冰浴 30min 后吸掉多余的胰酶，37恒温箱酶切 12-16h。9. 肽段提取：将 EP 管盒整个放入超声仪中超声 15-20min，吸出肽段，3.6 质谱检测1.

32、 肽段用样品溶解液（0.1%甲酸、2%乙腈）溶解，充分振荡涡旋，13200rpm，4离心10min，上清转移到上样管中，进行质谱鉴定；2. 液相参数色谱柱信息：300 um i.d. x 5mm, packed with Acclaim PepMap RSLC C18, 5 um, 100,nanoViper，流动相 A：0.1%甲酸，流动相 B：0.1%甲酸，80%ACN，流速：300nL/min， 每个组分分析时间：60min时间B 相05%55%5090%5590%585%6053.7 质谱参数分离后的肽段直接进入质谱仪 Thermo Scientific Q Exactive 进行在线

33、检测，具体参数如下： 一级质谱参数：Resolution：70,000 ；GC target：3e6 ；aximum IT：40 ms；Scan range：350 to 1800 m/z；二级质谱参数：Resolution：17,500；AGC target：1e5 ；Maximum IT： 60 ；ms TopN ：20；NCE / stepped NCE：27。3.8 数据库检索质谱原始文件经过 MM File Conversion 软件处理转换，得到 MGF 格式文件，然后用MASCOT 检索，检索参数如下：1. 固定修饰（Fixed modifications）：Carbamidom

34、ethyl (C)2. 可变修饰（Variable modifications）： Oxidation (M)3. 酶（Enzyme）：Trypsin4. 遗漏酶切位点（Maximum Missed Cleavages）：25. 一级质谱误差（Peptide Mass Tolerance）：20ppm6. 二级质谱误差（Fragment Mass Tolerance）：0.6Da7. 肽段/碎片离子质量数（Mass values）：Monoisotopic（单同位素）8. 显著性阈值（Significance threshold）：0.053.9 酵母单杂交提取广藿香叶片总RNA。取前期冻存的

35、广藿香叶片，用试剂盒提取广藿香对照组、茉莉酸甲酯组幼叶的RNA,所提取得到的RNA ,28S和18S条带清晰且完整性好。构建目的蛋白基因-pGADT7 的载体。根据目的蛋白基因序列设计带 EcoR和 BamH酶切位点的引物。提取广藿香总RNA,进行反转录合成cDNA,以广藿香cDNA为模板进行 PCR扩增，合成目的蛋白基因引物，引物末端具有与pGADT7相同的酶切位点。反应条件为: 95 5 min; 95 45 s， 56 45 s，72 1 min，循环数为35; 72 7 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，然后切胶、回收，同时用EcoR和 BamH酶分别对 pGADT7载体进行酶切

36、，经琼脂糖凝胶电泳检测后切胶分别回收线性载体，再用T4 DNA 连接酶将酶切后的目的蛋白基因和pHis2的回收片段进行连接，转化大肠杆菌DH5。将菌落挑至5mL LB菌液，37 ，225rpm过夜摇菌。送金唯智公司进行测序。最后，将得到的阳性菌株，提取其质粒。酵母单杂筛选pHis2-FPPS-pro/pHis2-PTS-pro载体酵母与目的蛋白的互作。酵母转化参照Clontech 操作手册( Protocol NoPT3529-1) 进行。将 pHis2-FPPS-pro/pHis2-PTS-pro载体和目的蛋白基因载体转化酵母 Y187 菌株，分别接种到SD /-Trp /-His，SD /

37、-Trp /-His/-Leu 3-AT 0 mmolL-1，SD /-Trp /-His/-Leu 3-AT 40 mmolL-1，SD /-Trp /-His/-Leu 3-AT 100 mmolL-1，SD /-Trp /-His/-Leu 3-AT 200 mmolL-1选择培养基上，在 30下培养 35 d，观察在各选择培养基上的生长情况。根据酵母的生长情况选择最适合抑制浓度。4 结果与分析4.1 核蛋白提取及生物素探针的制备图3 核蛋白提取（A）及链生物素的PTS（B）及FPPS（C）启动子基因PCR扩增结果PCR扩增链生物素的PTS及FPPS启动子基因后，其条带单一明亮，且大小与

38、启动子序列大小一致，可切胶回收用于后续试验。4.2 DNA Pull-Down 结果图4 PTS（左）和FPPS（右）基因DNA Pull-Down结果备注： M：Marker；CK组：对照组；MeJA组：茉莉酸甲酯诱导组如图所示为FPPS和PTS基因条带的DNA Pull-Down结果， PatPTS DNA Pull-Down拉下蛋白中，CK组蛋白较MeJA组的多，而PatFPPS DNA Pull-Down拉下蛋白则MeJA组蛋白较CK组的多，而质谱结果也相符合，结合两者可以更好地观察其启动子结合蛋白。 利用蛋白编码，在NCBI及Uniprot等蛋白数据库查找下载编码蛋白的mRNA序列。

39、并利用本地Blast方法，将查找得到的蛋白mRNA序列与广藿香第三代文库数据比对，得到匹配度较高的同源序列编号，Notepad软件将数据库打开，查找编号对应的序列下载并保存。表 LC-MS鉴定PatPTS及PatFPPS启动子DNA Pull-Down候选结合蛋白结果序号基因组别蛋白编号蛋白名称1PTSCK AKN09592.1 basic helix-loop-helix transcription factor Salvia miltiorrhiza 2XP_020549723.1 zinc finger BED domain-containing protein RICESLEEPER

40、2-like Sesamum indicum 3XP_011080558.1 TPR repeat-containing protein ZIP4 Sesamum indicum 4XP_011097010.1 uncharacterized protein LOC105176032 Sesamum indicum 5MeJA AKN09577.1 basic helix-loop-helix transcription factor Salvia miltiorrhiza 6FPPSCK XP_011091279.1transcription factor GTE1-like Sesamum

41、 indicum 7XP_011100775.1bZIP transcription factor 53-like Sesamum indicum 8MeJA AML76802.1 putative LOV domain-containing protein Vitex agnus-castus 9AMR58298.1 B-box transcription factor Ocimum basilicum 1AKN09592.1 basic helix-loop-helix transcription factor Salvia miltiorrhiza 10AOZ15900.1Elongat

42、ion factor 1-alpha Salvia divinorum 6XP_011091279.1transcription factor GTE1-like Sesamum indicum 11XP_011071899.1eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C-like isoform X1 Sesamum indicum 12XP_011086277.1 WEB family protein At1g12150-like Sesamum indicum 4.3 酵母单杂交实验结果表 PTS启动子结合蛋白序列引物蛋白描述引

43、物序列9592 basic helix-loop-helix transcription factor Salvia miltiorrhizaFGGAGGCCAGTGAATTCATGATGGACGATCCTCTATTAAGAAAATATAGTGTGARCGAGCTCGATGGATCCTCATTTGGTGGGCTTAAAGGGAGGzinc finger BED domain-containing protein RICESLEEPER 2-like Sesamum indicumFGGAGGCCAGTGAATTCATGGCTGAACTCGTAGATTTTAATGAAAAAGGRCGAGCTCG

44、ATGGATCCTTAAACATCCAATATCTCGATCTTCTCATCATCTGAASesamum indicum zinc finger BED domain-containing protein DAYSLEEPERFGGAGGCCAGTGAATTCATGGATTGGGGTGTTACTAATTCATACAATACCRCGAGCTCGATGGATCCTCAAGATCTGTGCCTTTTGCTGCT图5 PTS启动子候选结合蛋白酵母单杂交实验结果从结果可见，pGADT7-p53和pHis2-p53共转Y187酵母感受态细胞后，作为阳性对照，其在0、40和100mM的3AT SD /-Tr

45、p /-His/-Leu三缺板上均能生长；pGADT7+pHis2-PTS共转作为阴性对照，结果表明其在40和100mM三缺板能抑制生长，说明40和100 mM三缺板能抑制其自激活现象。而实验组9592bHLH+pHis2-PTS和BED-R+pHis2-PTS在40和100mM三缺板均能生长，说明广藿香9592 basic helix-loop-helix transcription factor（9592bHLH）和zinc finger BED domain-containing protein RICESLEEPER 2-like（BED-R）可能与PTS启动子有结合活性。5 结论本研

46、究对广藿香进行MeJA诱导处理并设置对照组，大量扩增PatPTS及PatFPPS启动子序列，设计并获得带有生物素的生物素标记PTS及FPPS探针，分别与广藿香MeJA组及CK组提取的蛋白，链亲和素标记的磁珠孵育，形成磁珠DNA蛋白质复合物，然后进行洗脱后，通过SDS-page、质谱（MS）鉴定蛋白质，对广藿香醇生物合成PTS及FPS基因启动子结合蛋白进行初步筛选，获得了两种（9592bHLH和BED-R）可能与PTS启动子有结合活性的蛋白，在揭示响应外源激素MeJA诱导的广藿香醇代谢与表达调控机理的道路上更进一步，同时有利于更好地认识广藿香药效成分萜类化合物的合成及调控机制，萜类生物合成途径及

47、其调控因子还有待更深的探究。【参考文献】1 国家药典委员会.中华人民共和国药典（第一部）M.北京：中国医药科技出版社,2015:236.2 李春龚,吴友根,林尤奋,张军锋,梁振益,范春蕾,敖霄.广藿香化学成分的研究进展J.江苏农业科学,2011,39(06):498-500.3 徐雯,吴艳清,丁浩然,修彦凤.广藿香的药理作用及机制研究进展J.上海中医药杂志,2017,51(10):103-106.4林彦君,许莉,陈佳江,罗方利.川藿香与广藿香挥发油化学成分GC-MS对比分析J.中国实验方剂学杂志,2013,19(20):100-102.5张志军,张桂芝,王朋朋.广藿香挥发油的红外光谱鉴定和气相色谱-质谱分析J.中国医药科学,2015,5(01):86-88+91.汤丽云,何国振,等.道地春油化学成分的研究J.中国药学杂志.2001(04):236-237.6 齐乐辉,