SN∕T 3198-2012 猪盖塔病RT-PCR检测技术规范(出入境检验检疫).pdf

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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 猪盖塔病犚 犜 犘 犆 犚检测技术规范犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 狅 犳犚 犜 犘 犆 犚犳 狅 狉 狊 狑 犻 狀 犲犵 犲 狋 犪 犺犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准猪盖塔病 犚 犜 犘 犆 犚检测技术规范 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号

2、：定价 元书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国南京出入境检验检疫局、南京农业大学。本标准主要起草人：王凯民、赵晓燕、姜焱、侯玉峰、李正高、郁兵、刘骏、唐泰山、陈国强、周斌、张常印。犛 犖犜 猪盖塔病犚 犜 犘 犆 犚检测技术规范范围本标准规定了猪盖塔病的检疫规范。本标准适用于猪盖塔病的流行病学调查和口岸检疫。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实

3、验室用水规格和试验方法缩略语下列缩略语适用于本文件。：盖塔病试剂与材料 试剂 电泳缓冲液 配制方法见附录 ，琼脂糖凝胶板制备见附录 。人工合成的猪盖塔病病毒 基因片段作为阳性对照，以 处理的灭菌蒸馏水作为阴性对照。引物：引物（）：引物（）：反应试剂：反应缓冲液、反转录酶、酶和犜 犪 狇酶、处理灭菌蒸馏水。电泳加样缓冲液：。相对分子质量标记：。材料 热循环仪。电泳仪。凝胶成像系统。操作方法 样品处理 蚊虫样品处理取待检的蚊虫整体与用 处理水配置的 研磨液按 比例混合置于研磨器中，在冰浴犛 犖犜 中研磨，取上清液，备用。猪及其产品的处理用带有抗凝剂的采血管采集待检猪的血液混匀；或将组织样品与用 处

4、理水配置的 研磨液按 比例混合，在冰浴中研磨取上清液，备用。样品 犚 犖 犃的制备 取 预处理的样品，加入 提取液 ，振荡混匀，室温放置 。加入 三氯甲烷，剧烈振摇，室温放置 后，离心 （）。吸上层水相于另一新离心管中，加入 异丙醇，充分混匀，放置 后，离心 （）。弃去上清液，加 乙醇，振摇混匀，充分洗涤沉淀，离心 （）；弃去上清液，室温自然干燥至管壁上无水珠，溶于 处理水中，保存备用。犚 犜 犘 犆 犚反应体系配制采用 的反应体系：、（）、（各 ）、（）、（）、犜 犪 狇（）、上游引物 （）、下游引物 （）、模板，加无 酶的水至总体积，同时设阴阳性对照。犚 犜 犘 犆 犚反应的循环程序将 管

5、放入 热循环仪中，按下列程序进行扩增：进行反转录；为：预变性 ；变性 ，退火 ，延伸 ，个循环；延伸 。从 热循环仪中取出之后，保存。犚 犜 犘 犆 犚扩增产物的电泳检测 扩增结束后，取 扩增产物分别和加样缓冲液混合后，加入到 琼脂糖凝胶（用含溴化乙锭的 溶液配制）加样孔中，在凝胶的合适位置加入标准相对分子质量标准。用电泳仪进行电泳，电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在 ，电泳时间为 。电泳结束后，将凝胶放在紫外光源下检查，用凝胶成像系统记录图像结果。结果判定观察记录的图像，阳性对照孔出现 条带而阴性对照孔未出现的情况下，实验成立。如果待检样品孔出现 条带，则猪盖塔病病毒核酸检测为阳性，对

6、扩增条带进行测序，其结果与附录中 序列比较，进行确认；如果待检样品孔未出现 条带，则猪盖塔病病毒核酸检测为阴性。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）试剂配制犃 电泳缓冲液犜 犃 犈的配制（倍）三羟甲基甲烷碱（）冰乙酸 （）乙二胺四乙酸（）蒸馏水 待上述混合物完全溶解后，加蒸馏水至 ，置冰箱中备用，如配制的琼脂糖凝胶和用作电泳缓冲液，则用蒸馏水稀释 倍成 缓冲液。犃 琼脂糖凝胶板制备取 琼脂糖（电泳纯）加入至 缓冲液中，在微波炉中充分溶解后，加入最终浓度为 的溴化乙锭，用 定容至 ，冷却至 后，倒入凝胶板中，在距离底板 的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔，凝胶的厚度为，待凝胶完全凝

7、固后，小心移去梳子，将凝胶板放入电泳槽中，加入恰好没过胶面约深的足量电泳缓冲液。犛 犖犜 书书书犛 犖犜 附录犅（资料性附录）猪盖塔病介绍及猪盖塔病病毒犆 犃 犘基因片段序列犅 猪盖塔病介绍猪盖塔病是由蚊虫传播的一种虫媒传染病，主要侵害马和猪。盖塔病毒（，）最初由美国陆军医学研究部门于 年从马来西亚的雪背库蚊（犆犵 犲 犾 犻 犱 狌 狊）中分离获得，命名为 ，其原型株为 。此后在日本、前苏联的东部、东南亚和澳大利亚等地，从三带吻库蚊和刺忧伊蚊及猪血液中也分离到盖塔病毒。该病毒属披膜病毒科（）甲病毒属（）。对鹅的红血球有很高的凝集性，能在各种脊椎动物和节肢动物体内增殖。据报道，该病毒与甲病毒属

8、中的非洲基孔肯雅热病毒（）和澳大利亚罗斯河（）病毒存在部分交叉反应。盖塔病毒含有单股 基因组，完整的病毒颗粒有种多肽，对氯仿和去氧胆酸盐敏感。易感细胞系有 ，等。自发现盖塔病毒以来，人们一直关注该病毒对动物的致病性。年在日本首次证明盖塔病毒对猪具有致病性，认为是日本初生仔猪的死亡原因之一。实验性感染妊娠母猪证明，该病毒可垂直感染而导致死产；对怀孕的母鼠接种后，产仔数明显减少，怀孕 的母鼠接种后所产乳鼠全部死亡。目前检测猪盖塔病主要的方法有病原分离，血凝和血凝抑制方法，其他分子生物学快速检测方法未见国内外有报道。病原分离需要的时间长，而且需要在生物安全三级实验室进行。犅 猪盖塔病病毒犆 犃 犘基因片段序列 犜犖犛书号：定价：元