SN∕T 4276-2015 国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测方法(出入境检验检疫).pdf

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1、书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光犘犆犚检测方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犢 犲 狉 狊 犻 狀 犻 犪狆 犲 狊 狋 犻 狊犻 狀狉 狅 犱 犲 狀 狋 狊犫 狔狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿犲犘犆犚犿犲 狋 犺 狅 犱犪 狋犳 狉 狅 狀 狋 犻 犲 狉狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光犘犆犚检测方法 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲号（）北京市西城区三里河北街 号（）总编室：（）网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印

2、张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、北京市海淀区疾病预防控制中心、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：田洁、陆琳、郭惠琳、何斌、刘艳华、任彤、赵静、黄恩炯。犛犖犜 国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光犘犆犚检测方法范围本标准规定了国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光检测方法的检测对象，标本的采集、处理、检测程序。本标准适用于国境口岸鼠疫耶尔森菌的荧光检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期

3、的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求 病媒生物感染病原体采样规程鼠类 病媒生物感染病原体采样规程蚤 国境口岸鼠类监测规程 国境口岸蚤类监测规程 鼠疫诊断标准人间传染的病原微生物名录（卫生部）术语和定义下列术语和定义适用于本文件。鼠疫耶尔森菌犢 犲 狉 狊 犻 狀 犻 犪狆 犲 狊 狋 犻 狊俗称鼠疫杆菌，为革兰阴性短粗杆菌，菌体两端钝圆且浓染，亦易被苯胺染料着色，大小为（）（）。一般分散存在，偶尔成双或呈短链排列，无鞭毛，不形成芽胞。鼠疫耶尔森菌是鼠疫的病原菌，鼠疫是一种人兽共患的自然疫源性烈性传染病，人类鼠疫多为疫鼠的

4、跳蚤叮咬而感染，是我国法定的甲类传染病。鼠疫传染性强，病死率高，易酿成大流行。鼠疫耶尔森菌主要累及皮肤和淋巴结，其次为败血症、肺炎、脑膜炎。缩略语下列缩略语适用于本文件。：聚合酶链式反应（）值：循环阈值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数（）：脱氧核糖核酸（）缓冲液犛犖犜 含 吐温 的 的磷酸盐缓冲液。生理盐水 的氯化钠水溶液。实验室生物安全要求按照人间传染的病原微生物名录规定，本方法中鼠疫耶尔森菌荧光检测应在 规定的生物安全级（）实验室内进行。检测对象 国境口岸疑似鼠疫耶尔森菌感染者的临床样品。国境口岸可能携带鼠疫耶尔森菌的医学媒介生物样品。国境口岸疑似鼠疫耶尔森菌污染的环境样

5、品。主要仪器设备本方法使用的主要仪器如下：实时荧光仪；二级生物安全柜；高压灭菌器；超低温冰箱（或液氮罐）；普通冰箱；高速台式冷冻离心机（最高转速 犵以上）；微量可调移液器（、）及配套的一次性带滤芯吸头；水浴锅；组织研磨器。试剂本方法使用的主要试剂如下：无菌生理盐水或三蒸水；（）；）给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。引物；阳性对照；阴性对照；探针。犛犖犜 检测程序 样本采集 鼠类样品的采集、运输和保存按照 、操作；蚤类样品的采集按照 、操作。临床样品的采集按照 操作。环境样品按无菌技术操作，取适量置于无菌容器中密封保存。在

6、采集过程中做好个人防护。样品检测 核酸提取 煮沸法提取核酸 以无菌方法称取 粉碎的固体环境样品，加入的无菌去离子水，充分振荡，离心，收集上清液，将上清液 ，离心，收集沉淀；沉淀中加入 无菌去离子水，沸水中加热；离心，上清液作为扩增的模板。以无菌方法吸取液体环境样品（如：水、饮料等），离心，去上清液，收集沉淀；加入 无菌去离子水，沸水中加热；离心，上清液作为扩增的模板。以无菌方法将 血液或体液样品置微型离心管中，沸水中加热；离心，上清液作为扩增的模板。以无菌方法取人类或鼠类组织样品 ，用 无菌生理盐水或三蒸水研磨；将经过鉴定的适量的蚤加 无菌生理盐水或三蒸水研磨，将制得的组织匀浆液转移至离心管中

7、，沸水中加热；离心，上清液作为扩增的模板。商品化犇犖犃提取试剂盒提取核酸用商品的提取试剂盒处理标本，具体操作参见该试剂盒说明书。荧光犘犆犚 引物和目的基因本方法使用的引物探针如下：上游引物 ：，位置为 ；下游引物 ：，位置为 ；探针 ：，位置为 。反应体系反应体系设置为，组成见表：犛犖犜 书 书 书犛犖犜 表犜 犪 狇犿犪 狀实时荧光犘犆犚反应体系组分使用量反应液 （）（）（）（）模板 反应体系为 ，不足的用灭菌蒸馏水补齐 扩增程序将加好样的反应管分别转移到荧光检测仪上进行扩增反应。程序设置为以 全自动荧光定量仪为例说明，将荧光信号设置为：，：，选择荧光信号校正。扩增程序为 ；，循环 次。由于

8、不同的荧光定量仪性能有差异，应按照实际机型进行反应程序设置，没有荧光通道的荧光定量仪，不进行的设置。基线和对照根据使用不同的荧光定量仪设定好基线，设定的一般原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整。阳性对照为鼠疫耶尔森菌基因组或含鼠疫耶尔森菌目的基因的质粒；阴性对照为不含鼠疫耶尔森菌的样品。结果判定 质量控制反应结果应同时符合以下个条件：阴性对照无扩增曲线；阳性对照 值 并有明显扩增曲线。否则实验视为无效。结果报告当同时进行的阳性、阴性和空白对照实验结果正常，本方法检验结果判定如下：检测样品有明显的荧光增幅曲线，且 值 时，判为阳性。检测样品荧光增幅曲线的 值在 和 之间时，建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光检测。若重新检测的 值有明显的减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，否则判为阴性。此类样本建议用其他方法进一步验证。检测样品无荧光增幅现象，判为阴性。犜犖 犛书号：定价：元