DB65∕T 4373-2021 阿魏菇种质资源保藏技术规程(新疆维吾尔自治区).pdf

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1、ICS 65.020.20 CCS B 05 新疆维吾尔自 J同日日65区地方标准DB 65/T 4373-2021 阿魏菇种质资源保藏技术规程Technical regulation for preservation of pleurotus eryngii var.ferulae gerrnplasm resources 2021-06-29发布2021一0901实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局发布DB 65/T 4373-2021 目IJ本文件按照GB/T1.1-2020 标准化工作导则第l部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由新疆农业科学院植物保护研究所提出。本文件由新

2、疆维吾尔自治区农业农村厅归口并组织实施。本文件起草单位:新疆农业科学院植物保护研究所。本文件主要起草人:贾培松、努尔孜亚亚力买买提、贾文捷、孙冰、罗影、魏鹏、艾力马合木提、山其米克、王卉、丁丽丽、王艺华、祖丽比亚吾布力、玛依拉阿布都克力木、i草草、海纳尔毛地热合曼、钟晓英、肖春燕、牛康康。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区农业农村厅、新疆农业科学院植物保护研究所。本文件的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区市场监督管理局(乌鲁木齐市新华南路167号)、新疆维吾尔自治区农业农村厅(乌鲁木齐市胜利路157号)、新疆农业科学院植物保护研究所(乌鲁木齐市南昌路403号。新疆维吾尔自治区市

3、场监督管理局联系电话:0991-2817197;传真:0991-2311250;邮编:830004 新疆维吾尔自治区农业农村厅联系电话0991-2878226;邮编830000新疆农业科学院植物保护研究所联系电话0991-4524641;传真0991-4524641;邮编830091I DB 65月4373-2021阿魏菇种质资源保藏技术规程1 范围本文件规定了阿魏菇种质资源保藏技术相关的术语和定义、种质资源收集、保藏和管理的规范要求。本文件适用于阿魏菇种质资源，包括栽培品种资源、野生菌株资源和育种中间材料的保藏与管理。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少

4、的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件:不注目期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。GB/T 12728食用菌术语NY/T 528食用茵茵种生产技术规程NY/T 1742食用茵茵种通用技术要求3 术语和定义GBIT 12728界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 种质资源germplasmresource 具有特定种质或基因，可用于育种栽培或其他生物学研究的各种类型及品种，包括野生种、地方品种、选育品种、品系、特殊遗传材料等。3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 栽培菌株cu1tivatedstrain 可进行人工栽培的菌株。野生菌株

5、wildstrain 生长于自然环境中，未经人工驯化的菌株。育种的中间材料intermediatematerials for breeding 单阻菌株、原生质体单核化商株、杂交菌株、诱变菌株、多倍体菌株、转基因菌株等。母种stockculture 经过各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物。商种culture生长在适宜基质上具结实性的菌丝培养物，包括母种、原种和栽培种。纯培养purecu1ture 只让单微生物生长繁殖的培养或只有单一微生物的培养物。DB 65fT 4373-2021 3.8 继代培养subculture通过移植培养使物种得以延续的方法。3.9 菌种保藏c

6、ulturepreservation 指使菌种免受其他微生物污染，保持其固有遗传、生理、形态及各种有研究和利用价值特性的微生物学技术。3.10 3.11 3.12 菌丝hypha拉状真菌的结构单位，由管状细胞组成，有隔或无隔，是菌丝体的构成单元。菌丝体mycelium菌丝的集合体。子实体企uitbody 产生抱子的真菌组织器官。如子囊果、担子果。注:食用菌中供食用的菇体和耳片都是子实体。3.13 手中性characters ofvariety 食用菌的品种特性，是鉴别食用菌菌种或品种优劣的最要标准之一。一般包括生理特性、农艺性状和商品形状。3.14 菌种老化senescecce菌种随着培养时间

7、的增加，生理机能衰退的现象。3.15 菌种退化degeneration菌种再生长和栽培过程中，由于遗传变异导致优良性状下降。3.16 菌种复壮rejuvenation良种繁育中防止菌种退化的技术措施。3.17 角变sectoring因菌丝体局部变异或感染病毒而导致菌丝变细、生长缓慢、菌丝体表面特征成角状异常的现象。3.18 吐7.1water exudation 菌丝培养期间分泌的液体，常积聚在培养基表面，虽半透明或黄色水珠状。4 种质资源收集4.1 收集对象包括栽培菌株、野生菌株、育科的中间材料。4.2 收集方法与程序2 DB 65/T 4373-2021 采用野外采集、合作研究、菌株交换、

8、友情捐赠、委托保藏、商务购买等方式收集，及时填写菌株收集记录表，见表1，必要时签订菌株合作保藏或委托保藏抽议，一个月内完成菌种鉴定和提纯工作，确保收集的菌株真实可靠且为纯培养，然后正式编入阿魏菇种质资源库保种目录并入库保藏。表1茵株收集记录表商株号a材料b地点c时间d方式e提供方f签章且备注ha菌株号:收集对象是生产用种，登记其品种名称。野生资源或育种中间材料，登记其商株代号。b材料:收集对象是母种、原种、栽培种、栽培基质、自然生长基质、栽培来收的子实体、市场购买的子实体或野外来集的子实体等。c地点:收集地。d a才问:收集年月日。e方式:野外来集、合作研究、菌株交换、友情捐赠、委托保藏、商务

9、购买等。f提供方:收集材料提供单位或个人，野外来集则登记为自来。E签章:收集材料提供方代表的签名或盖章，野外来集登记采集者签章。h备注:表内未登记的其它相关信息，如野生菌株的生境和地理信息等。5 种质资源保藏5.1 保藏形式以纯培养的菌丝体为保藏形式，即以母种形式保藏，母种制备应符合NY/T528和NY/T1742规定的要求。5.2 保藏方法5.2.1 短期保藏采用定期移植保藏法，按附录A的规定方法进行。5.2.2 中期保藏采用液体石蜡保藏法，按附录B的规定方法进行。5.2.3 长期保藏液氮超低温保藏法，按附录C的规定方法进行。6 种质资源管理6.1 要求6.1.1 由专人负责种质资源管理工作

10、，包括种质保存、信息记录、资料整理归档、档案审查等。6.1.2 种质资源保存信息要及时更新，及时收集、记录、分析和整理当年的各项技术资料，建立系统的技术档案。6.1.3 所有档案资料应同时保存纸质文档和电子文档，纸质文档内容应清晰明确，电子文档应有各份。6.1.4 每年分类整理，编号目录，装订成册，归档保存。3 DB 65/T 4373-2021 6.2 建立保种目录在电脑中创建命名为阿魏菇种质资游、保种目录的Excel文件，用表格记录保藏菌株的各项背景信息，并定期备份。保种目录见表2。表2阿魏菇种质资源库保种目录编号|原时|来源c(二级来源)短期库编码d短期库编码e短期库编码f注备-lil!

11、iT111 a编号:对每个保藏商株进行系统编号:编号前面英文字母表示种类的拉丁文缩写;后面4位阿拉伯数字表示保藏商株序号。b原编菌号:在保科目录中记录菌株提供方提供的原始菌名菌号。c来源:即记录菌株提供方的单位名称或个人姓名及其所在地。若提供方能提供该商株的来掘地或获得方式，在本目录中作为二级来源记录在括号内。d短期库编码:各菌株在短期库中都有一个编码，由5个数字组成，标明保藏的位置、第1、2个数字表明冷藏柜的编号;第3个数字表示柜内有机菠璃保科架编号;第4个数字表示架上从左到右第几列;第5个数字表示列中从前到后第几行。可以根据菌株的某个信息通过电脑查询方便地查找其他相关信息:便于管理使用时存

12、取。e中期库编码:与短期库编码意义相同。f长期库编码11个数字组成，标明冻藏的时间和保藏位置。第(l2)个数字表明冻藏的年份(3的个数字表示冻藏的月份;第(56)个数字表示冻藏的日期;第C78)个数字表示液氮罐编号;第9个数字表示罐内保种组号，每个被氮罐有6个缺口，可保藏6组保藏杯:第10个数字表示组内保藏杯编号，每组保藏10个保藏杯;第11个数字表示保藏杯中冻藏管编号，每个保藏杯内装有5管冻藏管。6.3 库藏更新短期、中期与长期保藏库保藏的菌株，为确保种性与活力的稳定性，均有一定的保藏期限，要求在期限内及时转管更新，避免出现菌丝失活、培养基干缩、污染杂菌等问题。6.3.1 短期库更新以标签上

13、的接种日期为准，每隔3个月5个月更新1次。即将库藏菌株母种取出，在无菌条件下挑取1块5mmX5 mm大小的菌块接种至马铃薯葡萄糖琼踊培养基(PDA)平板，于250C培养箱黑暗培养活化5d7 d，在无菌条件下转接入新的PDA斜面培养基中，于250C培养箱黑暗培养，菌丝长满试管斜面后3d5 d再重新入库保藏。6.3.2 中期库更新以标签上的接种日期为准，每隔3年5年更新1次。更新时取出库藏菌株母种，在无菌条件下挑取1块5mmX5mm大小的菌块，用无菌滤纸吸干矿物油，转接至PDA培养基平板，于250C培养箱黑暗培养5 d7 d，在无菌条件下转接入新的PDA斜面培养基中，于250C培养箱黑暗培莽，茵丝

14、长满试管斜面后3 d5 d再重新入库保藏。6.3.3 长期库更新以保藏目录中的入库日期为准，每隔5年10年更新1次。更新时从长期库中提取保藏菌株母种，于350C恒温水浴锅中解冻，在无菌条件下挑取1块5mmX5 mm大小的菌块，用无菌滤纸吸干甘泊，转接至PDA培养基平板，于250C培养箱黑暗培养5d7 d，在无菌条件下再转接入新的PDA培养基平板，于4 咔DB 65月4373-2021250C培养箱黑暗培养5d7 d，如此反复活化培养2次3次，再重新切取琼脂菌块，装入冻藏管中，注入甘油防冻剂，漫入液氮罐保藏。6.3.4 异常情况处理更新时若短期库中菌株出现菌丝生长不良，失活等问题，则弃之不用:从

15、中期库中提取相同编号菌株活化、转接更新;中期库更新若还有问题，则从长期库中提取相同编号菌株活化、转接更新。三童保险，以确保种性不变，并在种质资源库更新与维护管理登记表中做好记录，特殊情况应在备注栏中注明。5 DB 65月43732021人1原理附录A(规范性)定期移植保藏法亦称传代培养保藏法，是将菌种接种至适宜的PDA斜固培养基中，在最适条件下培养后，置于40C医用保藏箱进行保存，并间隔一定时间进行移植培养的方法。A.2 要求人2.1宜在接种培养后用硅殷塞封存。A.2.2 使用前检查确认菌种是否有老化、退化、角变、吐水等现象，移植传代不宜超过6次。A.3 方法A.3.1 培养基配置A.3.1.

16、1 配方A.3.1.1.1 PDA培养基去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馆水1000mLo A.3.1.1.2 加富PDA培养基去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母膏2g，磷酸二氧饵1g，硫酸镇0.5g，琼脂粉20g，蒸锢水1000mL。A.3.1.2 自己置将马铃薯切成厚度0.5cm0.8 cm的马铃薯片，加入蒸馆水1000mL，置于小铝锅或不锈钢锅煮沸30 min40 min，用4层纱布过滤，取马铃薯滤液，趁热加入葡萄糖、琼脂粉等成分，充分摇匀，补水至1000mL，摇匀即可。A.3.1.3 分装将配置好的培养基分装至规格为18mmX 180 mm的玻璃试管中，每管8mL

17、12mL，试管口应保持干净，随后塞入硅胶塞，并用牛皮纸包扎。人3.1.4贝菌将配置分装和包扎好的试管直立放在高压蒸汽灭菌锅内灭菌，灭菌压力为0.1 1MPa，温度121oC,时间为15min30 min。待压力归零，温度降至800C以下时，趁热取出试管，并倾斜摆放在桌面上，试管口比试管底高1.刀Ocm户户、寸、-A人.3.1.5灭商效果检查将灭菌后的PDA斜面培养基置于C30土2)oC条件下1d2 d，检查是否有细菌或霉菌的菌斑滋生。A.3.2 接种6 DB 65/T 4373一2021在无菌条件或超净工作台上，用接种针(或接种铲)挑取5mmX5mm大小的阿魏菇菌丝体，接种至PDA培养基斜面中

18、央，菌丝面朝上，接种启立即塞上硅胶塞，用牛皮纸包扎试管口，贴上标签。A.3.3 培养将接种后的试管置于(25士1)OC培养箱中黑暗培养7d10 d，当菌丝长满培养基斜面时结束培养。A.3.4 性状指标商丝体洁白、浓密、粗壮，萌发生长快，分布均匀，无吐水、变色和角变。A.3.5 保藏培养好的菌种子温度4吧，相对湿度50%60%环境下保藏。也可以将培养好的菌种沿试管口将露出试管的硅胶塞剪下，用干净的固体石蜡加热熔化后封口再保藏。A.3.6 定期移植阿魏菇菌种保藏时间不宜超过120d，每隔90d120 d将保藏的菌种转接到新鲜PDA培养基斜面中，在(25土。OC培养箱中黑暗培养7d10 d，当茵丝长

19、满培养基斜面时结束培养，再保藏。用固体石蜡封口的阿魏菇菌种可保藏l年。7 DB 65/T 4373一2021B.1 原理附录B(规范性液体石蜡保藏法菌种在适宜的斜面培养基上培养好后，注入灭菌的液体石蜡，在液体石蜡完全覆盖下进行保存的方法。B.2要求B.2.1 选用化学纯液体石蜡。B.2.2 操作时应防止液体石蜡燃烧。B.2.3 使用电子式火焰灭菌器对移种过培养物的接种铲灭菌。B.2.4 保藏场所应保持干燥，防止硅胶塞污染。B.2.5 保藏期间应定期检查，如培养基露出液醋，应及时补充无菌液体石蜡。B.3 方法B.3.1 液体石蜡准备将液体石蜡分装，塞上硅胶塞，用牛皮纸包好，在0.11MPa,12

20、1 oc条件下进行高温蒸汽灭菌15min 30 min，然后置于400C恒温箱，待水分完全蒸发，经无菌检查后备用。B.3.2 培养物制备应符合附录A.3.1的规定。B.3.3 石蜡灌注无菌条件下将灭菌的液体石蜡注入培养好的培养物上，液面高出培养物斜面1cm2 cm，塞上硅胶寨并用固体石蜡封口。B.3.4保藏将阴魏菇菌种直立存放于4oc医用保藏箱，于干燥处黑暗保存，保藏时间1年。保藏期间应定期检查菌种活力及杂菌情况，液体石蜡减少，露出培养基斜面时应及时补充经灭菌的液体石蜡。B.3.5 恢复培养挑取5mmX5 mm大小的菌种块转接到新鲜PDA培养基平板上，置于(25土1)oC培养箱黑暗培养，待菌丝

21、体萌发生长至菌落直径5cm8 cm时，再重新转接培养1次。8 DB 65月4373一2021C.1 原理附录c(规范性)液氮超低温保藏法将菌种先置于有冷冻保护剂的容器内，再保存于1500C气相液氮或-1960C的液相液氮中的保藏方法。C.2 要求C.2.1 操作时应戴上面具和皮手套，冻存管应拧紧螺帽。C.2.2 运送液氮应使用专用特制液氮罐，存放液氮罐的房间应保持良好通风。C.2.3 应防止安商管爆裂。C.2.4注意液氮罐中液氮的残存量，定期填充液氮。C.3 方法C.3.1 准备C.3.1.1 安缸管或;东存管选用耐温度骤变，耐压，管壁厚度均一且为中性玻璃的安部管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻

22、璃管不得有裂纹。清洗安顿管时，先用2%盐酸搜泡8h12 h，再用自来水冲洗3次以上，宜用蒸馆水冲洗，浸泡至pH中性后干燥。塑料冻存管用蒸锢水浸j包8h12 h，冲洗干净，干燥即可。在0.11MPa,1口21oC C 条件下高压蒸汽灭菌l归5m口旧由1让由ir尬nl户卢白、C.3.1.2 标签使用专用的非水溶性记号笔作标记，记录菌种编号和保藏日期。C.3.1.3 保护剂宜采用无菌的10%20%甘油作为保护剂。在甘油中加入蒸馆水，配置浓度为10%(体积分数或20%(质量分数)的甘油，再于0.11MPa,1口21oC条件下高f压E蒸汽灭菌l归5m口linl户严白、白C.3.1.4培养物将阿魏菇培养物

23、接种至PDA培养基平板上，于(25土1)oC培养箱黑暗培养7dr10doC.3.2 分装用无菌打孔器从阿魏菇菌落边缘1cm处切取直径为5mm10 mm大小的菌种块，放入冻存管内与保护剂混匀，保护剂用量以不超过冻存管高度的2/3为宜。菌种块和保护剂应置于冻存管底部，避免溅污上部管壁。分装完后立即封口。若用安瓶管保存，在距离管口5cm处用酒精喷灯将其熔封;如使用塑料冻存管保存，应立即拧紧螺帽。C.3.3 预冻预冻时，温度宜控制在每分钟下降lOC，至一35oC-40 oC。常用降温方法有:a)程序控温降温法:应用程序控温降温仪，稳定连续降温，控制好降温速率;9 DB 65月4373-2021b)冷冻干燥机自行冷冻:在不开启真空泵的情况下，利用冷冻干燥机的制冷作用，将菌种冷冻至-35oC-40 oC;c)将菌种放置于一800C冰箱预冻。植度控制在每分钟下降lOC，至一35oC-40 oCo C.3.4 冷冻保藏将预冻好的安瓶管或冻存管置于液氮罐中保藏。气相温度为一150oC，1夜相温度为一196oC。保藏周期5年，-.，10年。C.3.5 活化从液氮罐中取出菌种冻存管，立即置于37oC-40 oC水浴中轻轻摇动，直到融化为止。无菌条件下开启冻存管，将菌种块移接至加富PDA培养基平板上，于(25士1)oC培养箱黑暗培养，待商丝体萌发生长后，再重新转接培养1次。10