NY∕T 3436-2019 柑橘属品种鉴定 SSR分子标记法(农业).pdf

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1、ICS 65.020.01 B 05 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3436一2019柑槽属晶种鉴定SSR分子标记法Identiflcation of Citrus varieties-SSR marker method 2019-01-17发布2019-09-01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3436-2019 目次前言.n l 范围.12 规范性引用文件13 术语和定义.4 主要仪器设备及试剂.1 5 溶液配制.1 6 引物相关信息及使用7 参照品种及使用8 操作程序19 结果统计310 结果判定.3 附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂附录B(规范性附录)溶液配

2、制.7 附录规范性附录)核心引物名单及序列.附录D(规范性附录核心引物相关信息附录E(资料性附录)参照品种名单.mI NY/T 3436-2019 H 目U本标准按照GBjT 1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业农村部种业管理司提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SACjTC 277)归口。本标准起草单位:农业农村部科技发展中心、湖南农业大学、西南大学。本标准主要起草人:唐浩、李益、韩瑞笠、江东、邓超、马莹雪、李娜、邓子牛、赵艳杰。NY/T 3436-2019 柑桶属品种鉴定SSR分子标记法范围

3、本标准规定了利用简单重复ff.:vtlCSimple sequcnce rcpcat,SSR)标记进行芸香科CRutaceae)柑楠周CCitrus L.)品种鉴定的操作程序、结果统计姑且机1日l本标准适用于柑桶屈品种SSR2 规范性引用文件件。凡是不注日期的寻G/T 6682 NY/T 2435 NY/T 2594 3 术语和定义4 5 6 7 参照晶种及使用参!品种的名称参见附录E。产物。注多个品种在某一SSR位点上可能共有相同后，这些品种也可以代替附录D中的参照品利使用.B 操作程序8.1 样晶准备每份样品取不少于3个单株的叶片或其他等效物，混合分析.8.2 DNA提取应参!自品种的PC

4、R扩增31利!位2，等位变异大小与参照品种相同夺混合后的样品放入液氮预冷的研钵中，加入液氮后迅速研磨时片多次至粉末状，JjJ.适盘粉末装入2mL离心管。每管JJII人1mLJ:il热C65C)rJiJ2%CTA提JtlI.液，充分混匀，65C恒ffit7K浴45min60 NY/T 3436一2019min，其间每隔10min颠倒混匀。于40C,12 000 r/min离心15mino取上清液至一新离心管，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1,V:V)，轻轻颠倒混匀，静置10min，于40C，12000 r/min离心15mino取上清液至一新离心管，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，一200C

5、下静置30min。于40C，12 000 r/min 离心10min，弃上清液。70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，风干，加入50L超纯水，加1LRNase(10 g/L)，37DC温浴30min;再加入等体积的氯仿-异戊蹲(24:1,V:V)，于4DC,12 000 r/min离心15min;取上清液，加人等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，一20DC下静置30min;12 000 r/min常温离心15min，弃上清液。用70%乙醇浸泡洗涤DNA沉淀2次，风干，加入100L无菌水或TE缓冲液，通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，一200C保存。注:以上为推荐的DNA提取方法，所获D

6、NA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法都适用于本标准.8.3 P扩增8.3.1 反应体系各组分终浓度如下:每种dNTPO.20 mmol/L，正向、反向引物各0.25mol/L，Taq DNA聚合酶0.05 U/L，lXPCR缓冲液含Mg2+2.5 mmol/L)，DNA溶液2.5ng/L，其余以超纯水补足至所需体积。利用毛细管电泳进行荧光检测时需使用荧光标记的引物。引物标记的荧光颜色见附录D。注:反应体系的体积可根据具体情况进行调整。可采用2X Taq PCR master Mix代替TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg2+。8.3.2 反应程序940C预变性5min;94DC变性

7、40s，600C退火40s,720C延伸45s(可根据扩增片段的长度做出适当调整)，共35个循环;72DC延伸10min，4DC保存。注:预变性和变性温度可以是940C或者9S0C，根据所使用的Mix的要求调整。8.4 PI产物检测8.4.1 变性聚丙烯酷胶凝胶电泳(PAGE)8.4.1.1 清洗玻璃板将玻璃板清洗干净，用双蒸水擦洗2遍，95%乙醇擦洗2遍。在带凹槽的短板上涂1mL剥离硅炕工作液，长板上涂1mL亲和硅烧工作液。操作过程中防止2块玻璃板交叉污染。8.4.1.2 组装电泳板待玻璃板彻底干燥后组装，在玻璃板两侧的前中后位置用夹子固定，并用水平仪调平。8.4.1.3 灌胶在50mL 6

8、.0%PAGE胶中分别加入350L10%的过硫酸钱和35LTEMED，迅速混匀后灌胶胶的体积根据玻璃板的面积及盗鱼齿梳子厚度进行调整。灌胶过程中防止出现气泡。待胶液充满玻璃板夹层，将1mm厚的造鱼齿梳子平齐端向里轻轻插人胶液约0.4cm。胶液在室温下聚合2h以上。胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水清洗干净备用。8.4.1.4 预电泳将玻璃板与电泳槽组装，在正极槽下槽中加入1XTBE缓冲液800mL，在负极槽(上槽)加入1XTBE缓冲液1000mL(缓冲液具体用量视电泳槽型号而定)05 V/cm预电泳10min.20 min。8.4.1.5 变性在20LPCR产物中加入4L6X

9、加样缓冲液，混匀。在PCR仪上950C变性5min，取出，迅速置于冰上，冷却10min以上。8.4.1.6 电泳用移液器清除凝胶顶端气泡和杂质。将整鱼齿梳子梳齿端插入凝胶1mm-.2 mm。每一个加样孔点入3L-.5L样品，在胶板一侧点入DNAMarker 0 5 V/cm条件下电泳，使凝胶温度保持在约NY/T 3436-2019 50C，电泳1h2 h(电泳时间J&决于扩增片段的大小范围).注:具体功率大小极据电泳梢的规格型号和l实验室室温设定.8 4.1.7 银染a)固定:将附有凝胶的玻璃板浸入固定液中，使固定液没过凝!跤，在桥床上轻轻晃动5mil1;b)以洗:取:H玻硝板，用双蒸水深洗3

10、0S;c)染色将政硝板置于染色液中，使染色液没过凝!跤，在挤床上轻轻晃动2min.5 minj d)jl洗:用双蒸水快速漂洗，时间不超过30S;c)显;彭将玻璃板置于在显t液中，)定);将凝胶在固定液中定影g)rl洗用双蒸水!1M，:30 将胶板放在X9 结果统计样品的待测样品在9.4 结果记录纯合位点的等位变异大小数据记为X/x.JrII呗归赞惯:等位变异的大小，杂合位点的等位变异大小数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上的2个等位变异的大小，小片段数据在前、大片段数据在后。缺失位点的等位变异大小数据记录为0/0.示曹IJ1:样品在某个位点上仪Hl现1个等位变异，大小为160bp，Ji1

11、IJ该位点的等位变异数据记录为160;160.示19IJ2:样品在某个位点上有2个等位变异，分别为160bp.165 bp，j!tl该位点的等位变异数知日录为160/165.10 结果判定10 1 结果判定当样品间差异JL点数二泣，判定为不间当样品间差异位点数=l，!IJ定为近似飞当样品间差异位NY/T 3436-2019 点数=0，判定为极近似或相同。10.2 结果表述待测样品与对照样品或数据库中已知品种利用分子标记类型，采用检测平台，采用位点组合进行检测，结果显示:检测位点数为，差异位点数为，判定为(相同或极近似、近似、不同。差异位点小于2个位点时，推荐按照NYjT2435的规定进行田间鉴

12、定。4 NY/T 3436-2019 附录A(规范性附录)主要仪器设备及试剂A.1 主要仪器设备A.1.1 PCR扩增仪。A.12;:i压电泳仪:A.1.3 垂直也协1A.1.4 水平电f/JllA.1.5 A.1.6 A.17 A 1.8 A 1.9 A.1.10 A 1.11 A.1.12 A.1.13 A.1.14 A 1.15 A 1.16 A 117 A.118 A 1.19 A.120 A.2 主要试剂除非另有说明，在分析中A.2.1 十六炕;lj=乙基澳化ii.!iCCT八)。A.22 聚乙烯11比l嗡炕闹CPVP)。A.23 氯仿.A.24 异戊醉。A.2.5 异丙/IXoA.

13、2.6 乙二股四乙酸二俐CEDTAl。A27 三资rp在氨基甲炕CTris)。A.28 浓盐般。5 NY/T 3436-2019 A.2.9 氢氧化锅。A.2.10 10XBuffer缓冲液:含Mg2+25 mmol/L。A.2.11 4种脱氧核糖核昔酸:dATP、dTTP、dGTP、dCTP。A.2.12 氯化锅。A.2.13 Taq DNA聚合酶。A.2.14 琼脂糖。A.2.15 DNA分子量标准:DNA片段分布范围至少在50bp500 bpo A.2.16 核酸染色剂。A.2.17 去离子甲酷胶。A.2.18 澳盼蓝。A.2.19 二甲苯青。A.2.20 甲叉双丙烯酷胶。A.2.21

14、丙烯酷胶。A.2.22 硝酸。A.2.23 尿素。A.2.24 亲和硅烧。A.2.25 剥离硅烧。A.2.26 无水乙醇。A.2.27 四甲基乙二胶(TEMED)。A.2.28 过硫酸镀(APS)。A.2.29 冰醋酸。A.2.30 硝酸银。A.2.31 甲睦。A.2.32 DNA分析仪用丙烯酷胶胶液。A.2.33 DNA分析仪用分子量内标Liz500。A.2.34 DNA分析仪用电泳缓冲液。A.2.35 DNA分析仪用光谱校准基质，包括6-FAM、T灿r1RA、HEX和ROX4种荧光染料标记的DNA片段。6 B.1 DNA提取溶液的配制B.1.1 0.5 mol/L乙二股四称l仅186.1

15、g乙二胶EDTA完全溶解后，在103.4kPa(l21C B.1.2 0.5 mol/L 取25mL B.1.3 1 mol/L 称取40.0B.1.4 1 moI/称II且60.按24 1 B.1.7 TE缓冲液分别革取5mL Tris mL，在103.4kPa021C)B.2 PCR扩增溶液的配制PCR扩增溶液的配制使用超生也水。B.2.1 dNTP溶液附录B(规范性附录)溶波配制NY/T 3436-2019 500 1000 8.0)，定容至500用超纯水分别配jdATP、dTTP、dCTP、dGTP4种脱氧核事if核背股终浓度为100mmol/L的储存液，4利储存液各Illl.20L混

16、合，用超纯水720L定容，配制成每种核背酸终浓度为2.5mmol/L的工作液。在103.4kPa(l21C)条件下灭菌20min,注也可使用满足试验要求的商品dNTP溶液.B.2.2 SSR引物溶液开盖前瞬时离心10s，按照说Jf j书用超纯水分别配fti.E向引物和反向可|物终浓度为100mol/L的储存液，取10L储存液，加90L水定容至终浓度10mol/L的工作液.7 NYjT 3436一2019B.3 变性聚丙烯酷股凝胶电泳溶液的配制变性聚丙烯酷胶凝胶电泳相关溶液的配制使用超纯水。B.3.1 40%(WjV)丙烯酷股溶液分别称取190g丙烯酿胶和10g甲叉双丙烯酷胶溶于约400mL水中

17、，加水定容至500mL，置于棕色瓶中，于40C储存。B.3.2 6.0%(WjV)变性聚丙烯酷股胶溶液称取420.0g尿素，用去离子水溶解，分别加人100mL 10XTBE缓冲液和150mL 40%丙烯酷胶溶液，定容至1000mL。B.3.3 亲和硅炕缓冲液分别量取49.75mL无水乙蹲和250L冰醋酸，混匀。B.3.4 亲和硅统工作液分别量取1mL亲和硅烧缓冲液和5L亲和硅烧原液，混匀。B.3.5 剥离硅炕工作液分别量取98mL氯仿溶液和2mL二甲基二氯硅烧溶液，混匀。B.3.6 10%(WjV)过硫酸镀溶液称取1.0g过硫酸钱溶于10mL去离子水中，混匀，于4C保存(不超过5d)。B.3.

18、7 10 XTBE缓冲液称取三短甲基氨基甲烧(Tris碱)108g，棚酸55g，溶于800mL水中，加入37mL O.5 mol/L EDT A 溶液(pH8.0)，定容至1000mL。B.3.8 1 XTBE缓冲液量取50mL 10XTBE缓冲液，加水定容至500mL，混匀。B.3.9 6X加样缓冲液分别称取0.125g澳盼蓝和0.125g二甲苯青，加入49mL去离子甲酷胶和1mL 0.5 mol/L ED-TA溶液(pH8.0)，搅拌溶解。B.4 银染溶渡的配制银染溶液的配制使用双蒸水。B.4.1 固定液量取100mL冰醋酸，加水定容至1000mL。B.4.2 染色液称取19硝酸银，加水定

19、容至1000mL。B.4.3 显影液称取10g氢氧化锅溶于1000mL水中，用前加2mL甲醋。注:试剂配制用水需符合GB/T6682的规定.8 NY/T 3436-2019 附录C(规范性附录)核心引物名单及序列核心位点编号及序列见表C.l.，表C.l核心引物名单及序列引物编号引物名称上游引物序列(53)下游引物序列(53)Cs 1(TGTA)6 TTCGTCATCCTCATCCATC TCATCAAATCACOCAAACGA Cs 2 SSR2 TOCACAAGGAGAAGAAAOGG GCGTCTIACTG1寸ACCGGGCs 3 TG16 GTGCGCAGTTATCTCAAA OCGAC

20、CACTTTTACCCACTG Cs 4 SSR5 CATCAGAAACGAGATGOCAA AAGGGCT AGAAGA TTCOCOC Cs 5 AAT12 TTGOCAAGAGA TTAAACGAACA GACGAGAGGTCCAGAAATCG Cs 6 TAA41 AGGTCTACATTGGCATTGTC ACATGCAGTGCTATAATGAATG Cs 7 TC26 CTTCCTCTTGCGGAGTGTTC GAGGGAAAGOCCTAATCTCA Cs 8(GTCT)5 CTTGTGTGTGCAGCTCGAT A TTCA TT AAAOCGACTGOC Cs 9 AGC9 TA

21、AAAAOCAACGTCCCCTCA OGGGCGAGGTAGAAGTAATG Cs 10 CMS30 AACAOCCCTTGGAGGGAG GCTGTTCACACACACAACOC Cs 11 CSSR140 CGCAAATGACTTCCCAGAAT GCTCCCTCCGA TTCTCTCTC cs 12 PL72 GTGAGGCAAAACGGAAAGAG GGGCCCATACAACGTAGAAG Cs 13 CSSR104 CAOGCAGCTTGAGTTTGAAG GTGCCGTTT AGGGTTTTCCT Cs 14 C1190 CAGGCAGTAACCTCOCAGAC AGCGAAAG

22、CTAATGATGGTG Cs 15 CSSR107 CGGGCTAGGCTGAGAGATA TCTTTGGAGCCGAACAACT Cs 16(CAA)52 GTGTGGTCCAGACTOCGTTT AAGA TTCTTT AACAAA TOCAAGGC Cs 17 F39 GATACAAATTAGCATTTGATTGAATGGA ATCGGGACTOGCA TT AGGGT Cs 18(TC)11 TCTCACGTCAAAAGACGACG TCGGCCATAAACCGATACAT Cs 19 GT03 GCCTTCTTGATACOGGAC TGCTOCGAACTTCATCATTG Cs 2

23、0 F04 AGTGAACTGTCCATTGGATICG GTG寸GAATOCCGACC寸CTACCCs 21(AAGA)5 GCAGCGCAACAACAT AACT A GGOCAATAGCTTCCA1寸CA注:品种拥有人可提供特异性位点。9 NY/T 3436-2019 核心引物相关信息见表0.10引物编号Cs 1 C,2 C,3 SROX 10 附录D(规范性附录)核心引物相关信息NY/T 3436一2019表D.l(续)引物编号染色体位置荧光标记常见等位变异，bp参照品种名称272 资阳香橙276 自楝橡279 资阳香橙285 大分4号298 黄花尤力克Cs 4 1 5ROX 301

24、墨西哥来橡313 北暗袖316 北暗抽322 墨西哥来橡328 红河大翼橙355 马叙167 北暗袖172 墨西哥来捺173 安江香抽176 北暗抽177 砂糖桶179 小香梅180 资阳香橙182 联合酸橙Cs 5 2 5ROX 185 胡抽192 米尔斯威特甜拧橡194 巴西酸橙195 马叙197 南桶198 红河大翼橙200 砂糖桶201 黄花尤力克204 大香橡124 北暗袖125 通贤袖129 墨西哥来捺133 小香梅134 北暗袖135 纽荷尔脐橙137 华登山香袖139 砂糖楠143 黄花尤力克Cs 6 2 56-FAM 145 大分4号148 圆香梅152 资阳香橙155 年楠

25、158 资阳香橙161 红皮酸楠164 白悚捺168 墨西哥来橡180 公孙桶61-1190 77-1积袖193 77-1积袖11 NY/T 3436-2019 引物编号|染包体位jl1 荧光标记Cs 7 2 C写9Cs 10 3 56-FAM 12 表D.1(绥)常见等位变异tbp172 参照品种名称I甘情NY/T 3436-2019 表D.l(续)引物编号染色体位置荧光标记常见等位变异，bp参照品种名称200 胡袖202 龙安袖204 77-1枫袖206 大分4号209 资阳香橙211 困香梅Cs 11 3 5TAMRA 213 资阳香橙215 砂糖桶219 白擦楼221 拘头橙223 南

26、桶225 圆香梅227 大种橙209 纽荷尔脐橙210 砂糖桶215 安江香袖218 龙安抽221 大分4号224 马叙Cs 12 4 5TA岛假A225 砂糖椅227 胡袖230 墨西哥来橡233 小香梅239 墨西哥帜橙245 黄花尤力克140 墨西哥帜橙150 红河大翼橙152 马叙154 南桶155 年桶156 公孙桶61-1 158 大分4号159 砂糖桶56-FAM 161 白楝橡Cs 13 5 162 砂糖捕164 资阳香橙166 黄花尤力克167 红皮酸桶170 小香橡172 北暗袖174 梁平袖180 胡袖187 小香橡13 NY/T 3436-2019 引物编号|染色体位n

27、l荧光标记Cs 11 5 5TAMRA Cs 15 Cs 16 Cs 17 Cs 18 7 5HEX 14 表D.1(续)常见等位变异，bp255 参照品种名称黄花尤力克NY/T 3436一2019表D.l(续)引物编号染色体位置荧光标记常见等位变异，bp参照品种名称256 沃柑257 北暗袖Cs 18 7 5HEX 258 资阳香橙261 沃柑274 77-1权袖281 77-1帜袖151 砂糖桶153 资阳香橙157 资阳香橙160 红河大翼橙169 拘头橙170 砂糖桶Cs 19 8 56-FAM 171 联合酸橙172 北暗袖174 墨西哥积橙176 巴西酸橙178 马叙183 马叙1

28、89 墨西哥来橡137 北暗袖5TAMRA 144 大分4号cs 20 8 大分4号150 156 纽荷尔脐橙103 拘头橙106 砂糖楠SROX 110 资阳香橙Cs 21 9 马叙111 114 砂糖椅117 马叙注1:如果不采用标准推荐的荧光，则需要用参照样品校正数据。注2:对于附录D中未包括的等位变异，应按本标准方法，确定其大小和相应参照品种。15 NY/T 3436-2019 参!l!品种名单见表E.l。16 附录E(资料性附录)参照品种名单J EON-sgH星中华人民共和国农业行业标准柑楠属晶种鉴定SSR分子标记法NY/T 3436-2019*中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)邮政编码:100125网址:)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销+导*开本880mmX1230mm 1/16 印张1.5字数30千字2019年8月第1版2019年8月北京第1次印刷书号16109 4809 定价36.00元*争昏版权专有侵权必究举报电话(010)59194261 NY IT 3436-2019