SN∕T 5334.2-2020 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第2部分：转基因大豆(出入境检验检疫).pdf

《SN∕T 5334.2-2020 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第2部分：转基因大豆(出入境检验检疫).pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SN∕T 5334.2-2020 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第2部分：转基因大豆(出入境检验检疫).pdf（10页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5334.22020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 2 部分：转基因大豆Protocol of digital PCR for quantitatively detecting genetically modified plants and their derived productsPart 2:Genetically modified soybean2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 65.020.01CCS B 16中华人民共和国海关总署发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准SN/T

2、5334.22020前 言SN/T 53342020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法共分为 8 个部分：第 1 部分：通用要求及定义；第 2 部分：转基因大豆；第 3 部分：转基因玉米；第 4 部分：转基因油菜；第 5 部分：转基因棉花；第 6 部分：转基因马铃薯；第 7 部分：转基因苜蓿；第 8 部分：转基因甜菜。本文件为 SN/T 53342020 的第 2 部分。本文件按照 GB/T1.12020 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院，中华人民共

3、和国大连海关技术中心，中华人民共和国沈阳海关技术中心，中华人民共和国广州海关技术中心、中华人民共和国青岛海关技术中心、中华人民共和国深圳海关食品检验检疫技术中心、中华人民共和国上海海关。本文件主要起草人：曹际娟，郑秋月，肖西志，刘津，朱鹏宇，付伟，杨莉莉，徐君怡。I以正式出版文本为准以正式出版文本为准1SN/T 5334.22020转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 2 部分：转基因大豆1 范围本文件规定了进出口大豆中转基因品系特异性的数字 PCR（dPCR）定量检测方法。本文件适用于大豆种子、叶片中转基因成分定量检测。本文件检测限参见附录 A。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文

4、中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T 5334.1 转基因产品定量检测数字 PCR 方法 第 1 部分：通用要求及定义3 术语和定义SN/T 5334.1 界定的术语与定义适用于本文件。4 方法原理见 SN/T 5334.1。5 主要设备及试剂5.1 内源基因和外源基因：内源基因为大豆植物凝集素基因（Lectin）；外源序列为 FG72、MON87769、MON87708、MON87705、DAS-44406-6、DAS-81419-2、356043、43054

5、23、CV127、GTS 40-3-2、A5547-127、MON89788、A2704-12 品系外源基因插入位点 5 端跨边界序列，以及 DAS68416-4 品系外源基因插入位点 3 端跨边界序列。引物及探针序列参见附录 A。5.2 其他设备及试剂要求见 SN/T 5334.1 的规定。6 方法操作步骤6.1 一般性操作步骤一般性操作步骤见 SN/T 5334.1 的规定。6.2 数字 PCR 反应体系数字 PCR 反应体系配制见表 1。以正式出版文本为准2SN/T 5334.22020表 1 数字 PCR 反应体系试剂1终浓度2ddPCR Super Mix1内参基因上游引物参见附录内

6、参基因下游引物参见附录内参基因探针参见附录品系上游引物参见附录品系下游引物参见附录品系探针参见附录DNA 模板60 ng水补足至反应体系 注：推荐使用市面上现售的数字 PCR 平台进行实验，并针对市面上现售的不同数字 PCR 平台依据说明书调整反应体系的组分和最终体积，并保证表中所列组分的终浓度不变。6.3 数字 PCR 反应程序数字 PCR 反应程序见表 2。表 2 数字 PCR 反应程序反应温度/反应时间循环数热启动a955 min1热循环（扩增）b94见表 3见表 360见附录 a：根据不同数字 PCR 平台的要求，可以对反应程序中热启动步骤进行修改，但是不得修改热循环（扩增）步骤。b：

7、根据不同数字 PCR 平台的要求，有可能要在热循环（扩增）步骤结束后进行后处理，本后处理步骤按照不同数字 PCR 平台说明书进行。表 3 不同转基因品系对应的变性时间及循环数基因/品系变性时间/s循环数Lectin1549FG721549MON877691549MON877081549MON877051549DAS-44406-61549DAS-81419-2154935604315443054231544CV1273044以正式出版文本为准3SN/T 5334.22020基因/品系变性时间/s循环数GTS 40-3-23044A5547-1271549MON897881549A2704-12

8、1549DAS68416-415497 结果判定与表述结果计算方法见 SN/T 5334.1。结果表述如下：检测结果中内标准基因与外源基因均符合阴性以及空白的质量控制要求，说明未检出大豆内源基因 Lectin，表述为“未检出大豆成分”；检测结果中，内标准基因结果为阳性，但是外源基因符合阴性以及空白的质量控制要求，说明检出大豆内源基因 Lectin，但未检出 XXX 品系特异性序列，表述为“未检出大豆 XXX 转基因品系”；检测结果中，内标准基因与外源基因组均符合试样数字 PCR 检测的质量控制要求，说明该转基因品系 XXX 检测为阳性且满足定量要求，表述为“检出大豆 XXX 转基因品系，含量为

9、XX%。8 防污染措施防污染措施见 SN/T 5334.1 的规定。9 样品保存样品保存见 SN/T 5334.1 的规定。表 3（续）以正式出版文本为准4SN/T 5334.22020附 录 A（资料性附录）引物探针序列、反应程序以及检测限表 A.1 引物探针序列、反应程序以及检测限基因/品系名称序列（5-3）终浓度/（mol/L）退火时间/s定性检测限/L定量检测限/LLectin上游引物CCTCCTCGGGAAAGTTACAA40060下游引物GGGCATAGAAGGTGAAGTT400探针FAM-CCCTCGTCTCTTGGTCGCGCCCTCT-BHQ1200FG72上游引物AGAT

10、TTGATCGGGCTGCAGG400601.05.0下游引物GCACGTATTGATGACCGCATTA400探针FAM-AATGTGGTTCATCCGTCTT-MGBNFQ200MON87769上游引物CATACTCATTGCTGATCCATGTAGATT400601.57.0下游引物GCAAGTTGCTCGTGAAGTTTTG400探针FAM-CCCGGACATGAAGCCATTTACAATTGA-TAMRA200MON87708上游引物TCATACTCATTGCTGATCCATGTAG200601.08.0下游引物AGAACAAATTAACGAAAAGACAGAACG200探针FAM-

11、TCCCGGACTTTAGCTCAAAATGCATGTA-TAMRA100MON87705上游引物TTCCCGGACATGAAGCCATTTAC400601.08.0下游引物GCAACGGTGCCTTGGCCCAAAG400探针FAM-AAGAGACTCAGGGTGTTGTTATCACTGCGG-MGBNFQ200DAS-44406-6上游引物TTATTGTTCTTGTTGTTTCCTCTTTAGG400601.08.0下游引物CCTCAATTGCGAGCTTTCTAATTT400探针FAM-ATTCGGACCTCCATGATGACCTTACCGTT-TAMRA200DAS-81419-2上游

12、引物TCTAGCTATATTTAGCACTTGATATTCAT400601.255.0下游引物GCTTCAAGATCCCAACTTGCG400探针FAM-ATCAACAGGCACCGATGCGCACCG-TAMR200356043上游引物GTCGAATAGGCTAGGTTTACGAAAAA750603.05.0下游引物TTTGATATTCTTGGAGTAGACGAGAGTGT750探针FAM-CTCTAGAGATCCGTCAACATGGTGGAGCAC-TAMRA200305423上游引物CGTGTTCTCTTTTTGGCTAGC800603.06.0下游引物GTGACCAATGAATACAT

13、AACACAAACTA500探针FAM-TGACACAAATGATTTTCATACAAAAGTCGAGA-TAMRA220CV127上游引物AACAGAAGTTTCCGTTGAGCTTTAAGAC800401.85.0下游引物CATTCGTAGCTCGGATCGTGTAC800探针FAM-TTTGGGGAAGCTGTCCCATGCCC-TAMRA250GTS 40-3-2上游引物TTCATTCAAAATAAGATCATACATACAGGTT800401.512.2下游引物GGCATTTGTAGGAGCCACCTT800探针FAM-CCTTTTCCATTTGGG-MGBNFQ250以正式出版文本

14、为准5SN/T 5334.22020基因/品系名称序列（5-3）终浓度/（mol/L）退火时间/s定性检测限/L定量检测限/LA5547-127上游引物GCTATTTGGTGGCATTTTTCCA400600.964.8下游引物CACTGCGGCCAACTTACTTCT400探针FAM-CGCAATGTCATACCGTCATCGTTGT-BHQ1200MON89788上游引物TCCCGCTCTAGCGCTTCAAT400601.26.0下游引物TCGAGCAGGACCTGCAGAA400探针FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTG-BHQ1200A2704-12上游引物GAGT

15、TATTTATCAGCCAAGCATTC400601.286.4下游引物GCAGCACATCCCCCTTTC400探针FAM-AAGAGGCCCGCACCGACATAAGAA-BHQ1200DAS68416-4上游引物ATTAAAAACGTCCGCAATGTGT400601.05.0下游引物GTTTAAGAATTAGTTCTTACAGTTTATTGTTAG400探针FAM-TTAAGTTGTCTAAGCGTCAATA-MGBNFQ200表 A.1（续）以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 16 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1000书号：000000 定价 16.00 元转基因植物产品的数字PCR检测方法第2部分：转基因大豆行 业 标 准SN/T 5334.22020*网址 5334.22020