SN∕T 3199-2012 兔巴氏杆菌病检疫技术规范(出入境检验检疫).pdf
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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3199-2012 兔巴氏杆菌病检疫技术规范Quarantine proocol for Psteurellosis in rabbit 2012-10-23发布2013-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局N-ON|gEH军疫范样四而师叫山EJ机Mm时技U川-F疫出本检国k病白烟J且菌呻行附华巴中在冗SN/T 3199-2012 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)64275323争夺网址WWW.spc.口 rlr 11斗机、准山版丰|秦宁
2、宁岛印刷厂印刷手毛印张1.25 字数30下子2013年6月第一次印hrJIJ1/16 2013年6月第一版印数1-1600开本880X 1230)!J 定价21.00 予夺书号:155066 2-25380 SN/T 3199-2012 SN/T 3199-2012 目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草o本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国江西出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、河南农业大学O本标准主要起草人:杨春华、王凯民、祝建新、张睿、姜杂、孙思扬、沈艳、陈庆富、胡慧、付彤。兔巴氏杆菌病检疫技术规范1 范围本标准规
3、定了兔巴氏杆菌病样品处理、实验室检验和检疫后处理的技术。本标准适用于兔巴氏杆菌病的检疫。2 规范性引用文件SN/T 3199-2012 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的寻|用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 4789.28-2003 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB 16548 病害动物和病害动物产品生物安全处理规程3 疾病概述参见附录Ao4 初步诊断参照附录A中的临床症状和病理变化作出初步诊断。5 病原分离和鉴定5.1 材料5.1.1 试剂:草酸接结晶紫、革兰氏腆溶液、95%酒精、碳酸
4、复红、甲醇、瑞特氏染、美蓝染液、10%绵羊全1(11、健康动物红细胞5.1.2 1%蛋白陈水,配制方法见附录B中B.L5.1.3 血清肉汤,配制方法见附录B中B.2o5.1.4 马I氏肉汤,配制方法见附录B中B.30 5.1.5 10%血琼脂,配制方法见附录B中B.40 5.1.6 麦康凯琼脂,配制方法见附录B中B.50 5.1.7 前基质试验试剂,配制方法见附录B中B.60 5.1.8 氧化酶实验用试剂,配制方法见附录B中B.70 5.1.9 糖发酵培养基,配制方法见附录B中B.80 5.1.10 运动性培养基,配制方法见附录B中B.90 5.2 病原分离5.2.1 病料的采集5.2.1.1
5、 最急性和急性病例采集死亡兔只的肝、脾,心血;慢性病例采集局部病灶组织;对不新鲜或己SN/T 3199-2012 被污染的样品,可自骨髓中采集病料。采集病料时用烧红的刀片烧烙组织,而后用灭菌棉拭子或接种环通过烧烙表面插入组织或心血内取样。5.2.1.2 活兔,可通过鼻孔挤出粘液,或将棉拭子插入鼻裂中取样。5.2.2 病料涂片镜检5.2.2.1 抹片的制备用慑子夹持发生病变的肝或脾,然后以灭菌剪刀剪取小块,夹出后将其新鲜切面在载玻片上压印或涂抹成薄层;古以血液,用*-雨剪剪开心脏进行蘸llX或剪llX凝血块、用新鲜切由;在或政川伞上压CI1或涂抹成薄层。5.2.2.2 干燥自然风干。5.2.2.
6、3 固定将干燥好的抹片,涂抹面向上,以其背面在酒精火焰上来回通过数次.略作加热进行固定。5.2.2.4 革兰氏染色固定好的抹片上滴加草酸镀结晶紫,染色2min;水洗;加革兰氏腆溶液于抹片上媒染2min;水洗;加95%酒精于抹片上脱色1min;加稀释碳酸复红复染30S;水洗;吸干;镜检。本病原体为革兰氏阴性球杆菌或短杆菌,菌体大小为(0.2mO.4 fJ-m)X(0.6 fJ-m2.5 fJ-m),单个或成对存在,常有英膜Q5.2.2.5 其他染色法甲醇固定.按GB/T4789.28-2003中2.6或2.1规定进行,瑞特氏或美蓝染色呈两极浓染的球杆菌O5.2.3 接种培养基将采集的病料接种于血
7、清肉汤、马I氏肉汤、10%绵羊血琼脂斜面、麦康凯琼脂平板,含10%绵羊全血琼脂琼脂平板和含4%健康动物血洁的血清琼脂平板O将接币1后的斜由或半板,胃36oC37 oC,陆养18h24 h,观察结果G5.3 病原鉴定5.3.1 病原形态的以为多杀tl:I.j氏丰F雨,用肝脏到l织或心血抹川伞可见市兰氏染色阴性,瑞氏染色早|圳做浓染的球杆菌。5.3.2 培养特性本菌在血洁琼脂平板上培养24h后,生长成淡灰白色、露珠样小菌落,边缘整齐,表面光滑。血琼脂平板上可长成湿润的水滴样小菌落,周围不溶血。在血清肉汤或1%膜蛋白陈肉汤中培养,呈均匀浑浊,出现勃性沉淀,表面形成菌环O但慢性患病动物或带菌动物分离出
8、的病菌经培养后,长成粗糙、不透明的大菌落(中间型),或长成干燥、粗糙的菌落(粗糙型)。所有菌落类型在450折射光线下呈桔红色荧光CFo菌落型)。2 SN/T 3199-2012 5.3.3 生化特性1)5.3.3.1 糖发酵试验用1%蛋白陈水,将血洁琼脂平板18h24 h的培养物洗下,接种糖发酵管,置36oc 370C 培养7d10d,每天记录反应结果O本菌应发酵葡萄糖、果糖、半乳糖,多数发酵荒糖不发酵乳糖、肌醇、菊糖、水杨素及鼠李糖,各种糖发酵培养基配制见B.80 5.3.3.2 前基质试验用1%蛋白陈培养基的48h培养物加人肯定基质试剂。.5mL,沿管壁流下,覆盖于培养液表面,液面接触处呈
9、玫瑰红色,为阳性反应。5.3.3.3 氧化酶试验取白色洁净滤纸一角,蘸取菌落少许,加氧化酶试剂1滴,立即呈粉红色,为阳性反应,并于5日10 s内呈现深紫色。5.3.3.4 运动性试验用铀金耳钩取固体培养物接种运动性培养基倒置小试管的套管内,36oc 37 oc培养3d,在套管内生长,无运动性。5.4 动物接种试验5.4.1 丰才幸斗18 g22 g健康小白鼠4只、马I氏肉汤。5.4.2 方法取马I氏肉汤24h的培养物,用马丁氏肉汤稀释约为每毫升1000个菌体,皮下接种18g22 g 健康小白鼠4只。5.4.3 判定24 h48 h死亡,判为兔巳氏杆菌病S性o24 h以内死亡或48h以上死亡,需
10、重做Q6 血清学试验6.1 间接血凝试验6.1.1 丰才来斗6.1.1.1 多杀i:氏柯:声fA、B、D、E分群血清配制方法见附习毛Co6.1.1.2 新鲜红细胞配制方法见附录Co6.1.1.3 致敏红细胞配制方法见附录Co6.1.1.4 生理盐水、p日6.0磷酸盐缓冲盐水。1)5.3.3生化特性中所用到的试剂,如果其他等效商品化试剂具有相同的效果,则可使用这些等效产品。3 SN/T 3199-2012 6.1.2 操作方法6.1.2.1 分群血清于56oc水浴30min(除去非特异性的凝聚因子),用生理盐水作10倍稀释后再进行连续伯比稀释主第8管,取何个稀释皮0.2mL加到小|员|底试管。6
11、.1.2.2 每支小圆底试管加入致敏红细胞(见C中c.3)0.2 mLo 6.1.2.3 设对照组:血清对照:在0.2mL血清(5倍稀释)中,加入新鲜红细胞(见附录B中B.2)0.2 mL。新鲜红细胞对照:在0.2mL新鲜红细胞中,加入生理盐水0.2mL。抗原对照:在0.2mL致敏红细胞中,加人生理盐水0.2mL。6.1.2.4 充分振荡小圆底试管后,置室温20oC左右1h2 h判定结果O问J主rnr.凝试验程序见表I。表1间接血凝试验程序反应物血清对照1 2 3 4 5 6 7 血清稀释倍数5 10 20 40 80 160 320 血清最终稀释10 20 40 80 160 320 640
12、 倍数血清加量。.2。.2O.2。.2。.2O.2 O.2。.2第伞次加0.3%O.4弃去O.8 O.2 O.2 O.2 O.2 O.2 O.2 甲醒生理盐水第二次加0.3%O.2 O.2 0.2 O.2 O.2 O.2 O.2 甲醒生理盐水1%致敏红细胞。.2。.2O.2 0.2。.2O.2 O.2 O.2 1%新鲜红细胞O.2 6.1.3 判定8 打L/tf!,对照640 1 280。.2。.2弃去O.2 0.2 O.2 0.2 O.2 单位为毫升主IIII H包对照O.2 O.2 判定标准:每个试管按其管底红细胞的凝集现象分别记以#、十十十、十十、十、土及。以十+作为样品的滴度O#:红细
13、胞凝集形成坚实的凝块,边缘不整齐。十十十凝集的红细胞平铺管底,但有卷边或缺口。十十凝集的红细胞平铺管底O十红细胞凝集面积较小,有狭窄的增厚边缘或中心的红细胞凝集。土红细胞形成小的光滑圆盘,中心有不明显的红细胞凝集C 红细胞形成小的光滑圆盘。6.2 琼脂扩散沉淀试验6.2.1 材料6.2.1.1 琼脂粉1.0 g 0 6.2.1.2 8.5%氯化铀溶液100mLo 6.2.1.3 1%硫柳示溶液1mL。6.2.1.4 多杀性巳氏杆茵茵体分型血洁,116血清型。4 SN/T 3199-2012 6.2.1.5 抗原,制备方法见附录D。6.2.2 方法8.5%氯化铀溶液100mL,溶解优级琼脂1.0
14、 g,加热溶化后再加入1%硫柳示溶液1mL,混匀,凉至60O(左右,倒入平皿内,琼脂平均厚度2.5 mm3 mm,琼脂冷凝后,打孔,孔径4mm,孔与孔中G距离为6mm,每组7孔,中央孔加待检抗原,滴满为止,约0.03mL,分型血清分别加入到周围各孔。置36O(3 7 O(,24 h 4 8 h后判定结果。打孔及加样按图I所示o00 000 00 图16.2.3 判定待检抗原与某型分型血清孔之间出现明显沉淀线,即判定为该型兔巳氏杆菌阳性Q7 诊断判定根据临床症状和病理变化,加上涂片染色镜检,可对本病进行初步诊断o病原分离鉴定为阳性,可确险为兔U民杆声i耐阳tl:;血清学试验用来确立i二兔巳民丰1
15、:南血清群和血洁型,可对的!后精确鉴)J二。8 检疫后处理;在群体或个体检疫rr r,1L经综合判均为兔巳民丰F南捕者,其群休或个体均战GB/T16548处型。d SN/T 3199-2012 A.1 病原附录A(资料性附录)疾病概述本病病原.多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)属于巴氏杆菌科(Pasteurellacese),巴氏杆菌属(Pt们aellL本菌的形态为细小的短杆菌,两端钝圆,中央凸起,近似椭圆形O不形成芽币,无鞭毛和运动性,有英膜,普通染料均可着色,呈两极染色,革兰氏阴性菌O本菌DNA的(G十C)mol%为40.843.2。本菌为需氧或兼性厌氧菌,生长最适
16、温度为37oC,pH为7.27.4。在血清琼脂平板上24 h后,生长成淡灰白色、露珠样小菌落,边缘整齐.表面光滑。血液琼脂平板上可长成湿润的水滴样小菌落,周围不溶血。在血清肉汤或1%月亮蛋白陈肉汤中培养,呈均匀浑浊,出现秸性沉淀,表面形成菌环。本菌可以分解葡萄糖、庶糖、果糖、甘露糖和半乳糖,产酸,不产气O大多数菌株可发酵甘露醇。一般对乳糖、鼠李糖、杨音、肌醇、菊糖和侧金盏花醇不发酵O本菌可产生硫化氢和氨,能形成前基质O接触酶和氧化酶均为阳性,MR试验和VP试验为阴性O不液化明胶,石疏牛乳元变化O能还原硝酸盐为亚硝酸盐,能淫国关蓝,1M对拧核酸盐、内J酸盐、尿素悔、赖氨酸脱竣酶、七叶昔水解和ON
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