NY∕T 3063-2016 马铃薯抗晚疫病室内鉴定技术规程(农业).pdf

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1、ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3063一2016马铃薯抗晚疫病室内鉴定技术规程Code of practice for evaluation of potato resistance to late blight in greenhouse 2016-12-23发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布目Ijr:=:I 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则编写。本标准由农业部种子管理局提出并归口。本标准起草单位:中国农业科学院蔬菜花卉研究所。本标准主要起草人:杨宇红、谢丙炎、冯兰香、茹振JiI、凌键、陈国华。NY/T 3063-2

2、016 I NY/T 3063-2016 马铃薯抗晚疫病室内鉴定技术规程1 范围本标准规定了马铃薯抗晚疫病Clateblight)离体叶片和盆栽鉴定方法与评价标准。本标准适用于马铃薯(5olumtub三届自明民也-矗副材料对晚疫病抗性的室内鉴定及评价。2 术语和定义下列术语和定义2.1 马铃薯晚由致病疫种流行性卵溶化后，于(1213.3.2 选择性黑当100mL灭菌素、利福平和制霉菌素3.3.3 黑麦粒培养基在50mL离心管中加入3.3g 注意灭菌时不要将管盖完全拧紧，灭菌后3.4 对照材料h，用捣碎机捣碎使培养基中氨节青霉后，于(121士l)OC高压灭菌15mino 以马铃薯底西瑞(Desi

3、ree)，或费乌瑞它CFavurit)，等感病品种为感病对照。3.5 育苗基质将草炭、蛙石和菜田土按体积2:1:111昆合均匀，于(134士l)OC湿热灭菌1h。或直接购买商品化蔬菜育苗基质。3.6 其他用品培养皿、托盘、离心管、烧杯、量筒、锥形瓶、纱布、滤纸、酒精灯、细菌过滤器、小型手持喷雾器、育苗钵等。1 NY/T 3063-2016 4 仪器设备和设施4.1 显微镜放大倍率:40倍1000倍。4.2 恒温培养箱温度范围:00C500C，温度波动不大于lOC。4.3 高压灭菌锅灭菌温度范围:104 o C 1350C，灭菌时间范围:4min120 min.最高工作压力:O.25 MPaO.

4、22 孔IPa。4.4 移液器量程体积:2L20L，系统误差:士1.2%，随机误差:!:O.6%。4.5 电子天平称量范围:0gl 000 g，分度值:0.01g。4.6 捣碎机额定转速:10000 r/min 12 000 r/min，处理量:500mL，工作方法:断续。4.7 超净工作台洁净等级100级二三O.5m，菌落数:O.5个/(皿.h)(90 mm培养平皿)，平均风速:O.25 m/50.6 m/50 4.8 人工接种鉴定室具备人工调节、温度、温度及光照的条件，使人工接种后具备良好的发病环境。5 鉴定方法5.1 离体叶片法5.1.1 材料育苗将供鉴定材料及感病对照的种薯置于150C

5、200C下催芽。待薯芽长1cm1.5 cm时，将种薯切成每块只带1个健康芽眼的薯块，芽眼朝下播于装有育苗基质的育苗钵内，每钵播种1块，置于日光温室里，温度保持在180C250C，常规水肥管理，自然光照。待幼苗长到7片10片复叶时，选择生长一致、健壮的幼苗用于抗病性鉴定。5.1.2 接种体制备见附录1305.1.3 接种从植株顶部计起，取第3、4、5片展开叶，背面朝上置于双层湿润灭菌滤纸上，在每个小叶叶背主叶脉的一侧用微量移液器滴加10L浓度为8X103个子包子囊/mL的抱子囊悬浮液。每份材料设3个重复，每重复不少于6片复叶。5.1.4 接种后管理接种后将容器用保鲜膜封好，置于180C 200C

6、光照培养箱内，在每一日光照16h，黑暗8h，相对湿度100%条件下培养。5.1.5 病情调查5.1.5.1 调查方法接种后5d6 d，以复叶的每片小叶为调查单位，测定病斑面积及观察有元子包子囊和霉层，根据表1中的病害症状描述，逐份材料进行调查，记载接种叶片病情级别。NY/T 3063-2016 5.1.5.2 病情级别划分马铃薯抗晚疫病离体叶片法鉴定的病情级别划分见表1。表1马铃薯抗晚疫病离体叶片法鉴定的病情级别划分病情级别症状描述O 接种叶叶片上无症状仅在叶片上出现针尖大小的枯死斑2 病斑直径小于0.5cm，周围元褪绿晕圈3 病斑直径O.5cm1.0cm，病斑水浸状且周围有退绿晕圈，病斑表面

7、可见到白色菌丝体4 病斑继续扩大，占叶片总面积的1/2.病斑周围有明显的褪绿圈，并有明显的白色霉层3 病斑占叶片面积的23以上，病斑表面有大量的白色霉状物，并出现组织坏死5.1.5.3 病情指数计算病情指数(J)按式(1)计算。:(5 X)I=._ X 100 NXS 式中:I一一病情指数;5 一各病情级别数值;n 一一一各病情级别的病叶(株)数;N一一-调查的总叶(株)数;S一一病情级别的最高数值。5.1.6 鉴定材料处理鉴定完毕后，将马铃薯发病植株、残体集中进行无害化处理，用于鉴定的育苗基质采用高温灭菌。5.2 盆栽喷雾法5.2.1 材料育苗同5.1.1。5.2.2 接种采用喷雾接种法。将

8、在温室内生长1.5个月2个月的幼苗移到人工接种鉴定室进行喷雾接种，以叶片布满菌液但元滴落为度。接种液浓度为8X103个子包子囊/mL。鉴定材料随机或顺序排列，每份鉴定材料设3个重复，每一重复不少于10株苗。5.2.3 接种后管理接种后在100%相对湿度下保湿2d后，将相对湿度降为70%左右。接种期间温度保持在15.C20.(范围内，每天光照16h，待4d5 d发病后继续盖膜保持100%的相对湿度，24h后进行调查。5.2.4 病情调查5.2.4.1 调查方法接种后6d7 d 调查病情。以植株为单位调查每份鉴定材料接种后植株的发病情况，根据表2病害症状描述，逐份材料记载接种植株病情级别.按式。)

9、计算病情指数(J)。5.2.4.2 病情级别划分接种植株病情分级及其对应的症状描述见表2.3 NY/T 3063-2016 病情级别5.2.5 鉴定材料处理同5.1.6。6 抗病性评价6.1.2 鉴定当感病对6.1.3 抗性判依据鉴定材(参见附录C)。6.2 盆栽喷雾法抗6.2.1 评价标准抗性划分标准见表表2马铃薯抗晚疫病盆栽喷雾法鉴定的病情级别划分症状描述6.2.2 鉴定有效性判别当感病对照的植株达到其相应感病程度(DI30)，该批次鉴定结果视为有效。6.2.3 抗性判断同6.1.:o 4 NY/T 3063-2016 附录A(资料性附录)马铃薯晚疫病A.1 症状描述主要受害部位为叶状、绿

10、褐色斑点.以叶背最明显;雨条件下深褐色的坏片染病在叶尖或叶缘出现水渍在其周围产生一圈白霉，尤也可产生白色霉层，多，病斑组织为浅褐色至目CPeronos-枝。向一侧，生或侧柄，较易鞭毛收缩、无隔、自由分长，将抱子囊推细，于包子囊顶乳突，基部具短游动片刻后静止，.1)mX(23.5.2)m，藏卵器穿过不胃、-=-昭川囊光37了。为捆在学的度二存物菌温民滴生病成1水疫形过有3晚囊超要2子度均A抱温人59，最适pH为67;间接萌发产生游动于包子，若求相对湿度高于97%，萌发及侵囊的萌发。卵子包子存活能力很强，在3 NY/T 3063-2016 21mN T-4 E立CmT|上Q 0。?gJJifd 三

11、tA-。说明:1，2f包囊梗和他子囊;6 游动抱子;3、4一于包子袋7一一休止于包子;空于包子囊留有一休止饱子8休止抱子萌发。图A.1致病疫霉的形态特征引自中国真菌志)(第6卷)，1998J6 B.1 晚症病菌分离、保存B.1.1 分离附录B(规范性附录)接种体制备NY/T 3063-2016 将具有典型晚疫病症状的病叶用水冲洗去表面的污物后，叶背朝上置于灭菌的1.6%2.0%水琼脂培养基上，或叶背朝上放在灭菌的培养皿内。用95%酒精火焰消毒马铃薯薯块表面，切成厚约5mm的薄片，放于病叶上。封盖后将培养皿放在(19:!:1)OC培养箱内黑暗保湿培养，待叶背或薯片表面长出白色霉层(菌丝体和抱囊梗

12、)时，用灭菌挑针挑取白色霉层至选择性黑麦培养基上培养。分离物鉴定参照附录A.确认为致病疫霉后，采用挑取单抱子囊的方法进行分离物纯化，并保存备用。单抱子囊挑取方法:在超净台里，挑取薯片上或黑麦培养基平板上的菌丝，移入煎糖溶液(1000g/U中，配成于包子囊液。用移液枪取2L抱子囊液置于灭菌盖玻片上，镜检。当检查到该2L液滴里只有1个子包子囊时，将该盖玻片放人培养皿里，盖玻片上面压上薯片，置于07士1)OC恒温生化培养箱里培养，约5d后薯片上长出的菌丝即为单抱子囊分离物。B.1.2 保存将于包子囊悬浮液与15%二甲亚枫等量混合后置于液氮中保存;或将菌株移至黑麦粒培养基中.08士1)OC培养15d左

13、右，置于(14士1)OC恒温培养箱内保存。B.2 接种体繁殖、制备针对育种目的，选择相应的优势小种(小种鉴定方法参见附录D)或混合小种作为接种病原菌。将纯化的晚疫病菌菌株接种到黑麦培养基或表面消毒的感病马铃薯薯片上，置08士1)OC条件下黑暗培养，待于包子囊大量产生后(黑麦培养基上培养10 d14 d、马铃薯薯片上培养3d5d).用无菌水洗下抱子囊，双层纱布过滤后制成于包子囊悬浮液，血球计数器计数，加适量元菌水调整至接种浓度，接种前置40C冰箱中2h3 h诱发游动于包子的释放即为接种子包子悬浮液。7 NY/T 3063-2016 C.1 马铃薯抗晚疫病离体叶片法鉴定见表C.l。编号品种/种质名

14、称见表C.:20 编号感病对照8 附录C(资料性附录)鉴定结果原始记录表鉴定技术负责人(签字):NYj T 3063-2016 附录D(资料性附录)马铃薯晚疫病菌生理小种D.1 鉴别寄主国内外普遍采用的鉴别寄主为11个含有主效抗病基因R1-R11和l个不含抗病基因RO的马铃薯品种:R1(CEBECO 43154-5)、尼(CEBECO44158-4或Black1512c)、R3(CEBECO 4642-1)、阳(CEBECO 4431-5)、R5(Black 3053-18)、R6(Black XD2-21)、R7Black2182ef(7)J、R8Black 2424a(5)J、R9Blac

15、k2573(2)J、R10Black3681ad(1)J、R11Black 5008ab(6)J和RO(Bintje)。D.2 生理小种鉴定根据病原菌菌株对鉴别寄主的侵染性，以特定的侵染反应组合划分生理小种(见表D.1)。表D.l马铃薯晚疫病菌生理小种的鉴定鉴别寄生生理小种。1 2 3 4 D 6 7 8 9 10 11 1.2 1.3 1.4 2.4 3.4 1.2.4 1.3.4 2.3.4.Bintje S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S CEBECO 43154-5 R S R R R R R R R R R R S S S R R S S

16、R CEBECO 44158-4 R R R R R S R R R 或Black1512c R R R S R R S R S R S CEBECO 4642-1 R R R S R R R R R R R R R S R R S R S S CEBECO 4431-5 R R R R S R R R R R R R R R S S S S S S Black 3053-18 R R R R R S R R R R R R R R R R R R R R Black XD2-21 R R R R R R S R R R R R R R R R R R R R Black 2182ef(7)R R R R R R R S R R R R R R R R R R R R Black 2424a(5)R R R R R R R R S R R R R R R R R R R R Black 2573(2)R R R R R R R R R S R R R R R R R R R R Black 3681adO)R R R R R R R R R R S R R R R R R R R R Black 5008ab(6)R R R R R R R R R R R S R R R R R R R R 注:S表示感病;R表示抗病。9