GA∕T 1601-2019 法庭科学 生物检材中芬太尼检验 液相色谱-质谱法(公共安全).pdf

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1、 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA GA/T 法庭科学 生物检材中芬太尼检验 液相色谱-质谱法 Forensic sciencesExamination methods for fentanyl in biological samplesLC-MS-发布-实施 中华人民共和国公安部中华人民共和国公安部 发布发布 ICS 13.310 A 92 GA/T I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（SAC/

2、TC 179/SC 1）提出并归口。本标准起草单位：公安部物证鉴定中心、杭州市公安司法鉴定中心。本标准主要起草人：董颖、王瑞花、栾玉静、任昕昕、宋歌、董林沛、于忠山、何毅、王芳琳、张蕾萍、常靖、王炯、张云峰、应剑波、卓晓聪、李晓飞、田国刚。GA/T 1 法庭科学 生物检材中芬太尼检验 液相色谱-质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容等）中芬太尼的液相色谱-质谱（LC-MS）的定性定量检验方法。本标准适用于法庭科学生物检材中芬太尼的定性分析和定量分析。其他可疑样品中芬太尼的定性分析和定量分析可参照使用。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。

3、凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相色谱-质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，采用外标法进行定量分析。5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均

4、为分析纯，试剂包括：a）甲醇（色谱纯）；b）乙腈（色谱纯）；c）氨水；d）盐酸；e）乙酸铵；f）标准溶液：1)1.0mg/mL 标准物质溶液：根据芬太尼标准物质纯度和盐型换算后，用甲醇配制 1.0mg/mL芬太尼标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存。有效期 6 个月。或采用市售标准溶液；2）0.1mg/mL 标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质溶液 1.0mL，用甲醇稀释至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存。有效期 3 个月。实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液均由 0.1mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到。GA/T 2 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液。5.2 材料

5、 材料包括：a)具盖离心管；b)有机系微孔滤膜：0.22m；c)混合型阳离子交换（MCX）固相萃取柱：基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯苯高聚物，使用前依次用 1mL 甲醇、1mL 水活化。6 仪器和设备 仪器和设备包括：a）液相色谱-质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）和三重四极杆或离子阱质量分析器；b）电子天平；c）离心机；d）振荡器；e）移液器。7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g2.0g 于具盖离心管中。加入 0.1mol/L 盐酸 4mL，振荡 15min，8

6、000r/min 离心 15min，取上清液转移至已活化好的 MCX固相萃取柱中，依次用 0.1mol/L 盐酸 1mL、甲醇 1mL 淋洗，弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 1mL 5%的氨水/甲醇溶液（体积比 5:95）进行洗脱，收集洗脱液，置于浓缩器上 45浓缩至干，残留物用甲醇 200L 溶解，用 0.22m 的有机系微孔滤膜过滤，供仪器分析。7.1.1.2 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，一份添加芬太尼标准物质，作为添加样品（添加样品的浓度为10ng/mL(g)），与检材样品平行

7、操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 液相色谱-质谱仪（离子阱质量分析器）条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：XTerra RP18液相色谱柱（2.1mm 150mm，3.5m）或其他等效色谱柱；注：XTerra RP18是 Waters 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)流动相：65%乙腈:35%5mmoL/L 乙酸铵（氨水调节 pH 至 9.5）；GA/T

8、3 c)柱温：30；d)流速：0.2mL/min；e)进样量：10L；f)离子源：电喷雾电离（ESI）；g)检测方式：正离子；h)毛细管电压：4.5kV；i)毛细管温度：300；j)雾化气流速：35arb；k)锥孔气流速：5arb；l)相对碰撞能：32%；m)扫描模式：采用一级、二级质谱同时全扫描（SCAN）。7.1.2.1.2 液相色谱-质谱仪（三重四极杆质量分析器）条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：a)色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1mm 50 mm,1.7m)或其他等效色谱柱；注：ACQUITY UPLC BEH C18是Wa

9、ters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。b)流动相：A:乙腈，B:5mmoL/L乙酸铵(氨水调节pH至9)；c)洗脱：梯度洗脱，梯度见表1；表1 梯度洗脱条件 时间 min A B-10%90%1.5 90%10%2.2 90%10%2.5 10%90%4.0 10%90%d)柱温：35；e)流速：0.3mL/min；f)进样量：10 L；g)离子源：电喷雾电离（ESI）；h)检测方式：正离子；i)毛细管电压：3.0kV；j)源温度：150；k)雾化气流速：600L/h；l)锥孔气流速：5

10、0L/h；m)扫描模式：多反应离子监测（MRM）；n)MS 参考条件（定性、定量离子对和锥孔电压、碰撞能量）见表 2。表 2 MS 参考条件 检测目标物 定量离子对 定性离子对 锥孔电压 V 碰撞能量 eV 芬太尼 336.49187.90 336.49104.94 24 36 336.49187.90 22 GA/T 4 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按7.1.2.1的分析条件进样分析。7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品1.0mL2.0mL，或称取绞碎的肝脏等固体检材样品1.0g2.0g各两份，按7.1.1进行操作。另取等

11、量相似基质的空白样品三份，其中两份分别添加芬太尼标准物质作为添加样品（添加样品中目标物含量应为检材样品中目标物含量的(100 50)%），另一份作为空白样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器检测。7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按 7.1.2.1 规定的条件分析。7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1 的分析条件每个样品进样分析23 次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6 次。7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品提取液平行进样 23 次的目标物保留时间和峰面积值，按

12、公式（1）计算含量：添样添样添样VMAVMAW=.(1)式中：W检材样品中目标物的含量，单位为微克每克（g/g）或微克每毫升（g/mL）；A样检材样品提取液中目标物峰面积平均值；M添添加样品中目标物添加量，单位为微克（g）；V样检材样品的定容体积，单位为毫升（mL）；A添添加样品提取液中目标物峰面积平均值；M样检材样品的取样量，单位为克（g）或毫升（mL）；V添添加样品的定容体积，单位为毫升（mL）。7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按公式（2）计算相对相差：%10021=XXXRD.(2)式中：RD相对相差，用百分比（%）表示；X1、X2两个检材样品平行

13、定量测定的含量数值；X两个检材样品平行定量测定含量的平均值。GA/T 5 8 结果评价 8.1 定性结果评价 8.1.1 阳性结果评价 在相同条件下进行样品测定时，检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致（相对误差在 2.5%之内）、目标物的定性离子（至少两对定性离子）与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表3规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。相关谱图参见附录A。表 3 离子相对丰度比最大允许相对偏差范围 离子丰度比 50%20%50%10%20%10%最大允许相对偏差 20%25%30%50%8.1.2 阴性结果评价 检材样品未出现

14、与目标物标准溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与目标物标准溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。本方法检出限参见附录 A。8.2 定量结果评价 如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据可靠，其含量按两份检材样品的平均值计算。如果检材样品中目标物含量的RD20%，定量数据不可靠。应按7.2重新提取检验。芬太尼的中毒资料参见附录B。GA/T 6 附 录 A（资料性附录）芬太尼的检出限及相关谱图 芬太尼的相关谱图见图A.1 和图A.2。本方法芬太尼的检出限为 1ng/mL(g)。RT:0.00-9.030.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.

15、05.56.06.57.07.58.08.59.0Time(min)05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance3.212.231.131.931.494.112.385.415.105.734.576.13 6.297.180.596.850.187.41 7.808.608.12NL:7.16E6TIC F:+c ESI Full ms2 337.0032.00 90.00-400.00 MS 500ngml03_080904232412 图 A.1 芬太尼色谱图 GA/T 7 50ngml#157 RT:3.17

16、AV:1 NL:5.60E5F:+c ESI Full ms2 337.0032.00 90.00-400.00100120140160180200220240260280300320340360380400m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance188.07337.17216.04190.05281.11244.04134.01105.09146.09318.91220.42157.95373.16276.04119.94 图 A.2 芬太尼二级质谱图 GA/T 8 附 录 B（资料性附录）芬太尼的中毒诊断参

17、考资料 B.1 理化性质 芬太尼，英文名 Fentanyl,是 60 年代研制合成的阿片类药物，主要用于麻醉，化学名称为 N-1-(2-苯乙基)-4-哌啶基-N-苯基-丙酰胺，分子式为 C22H28N2O（分子结构见图 B.1），分子量为 336.46，熔点8384，脂溶性（辛酸/水=814）为吗啡的 1000 倍，最小致死量约为 2mg。图 B.1 芬太尼的分子结构 B.2 毒理作用 首次使用阿片制剂的患者，芬太尼的最小止痛血清浓度范围为 0.3ng/mL1.5ng/mL。在血清浓度高于 2ng/ml 以上时副作用的发生频率增加（与度冷丁相比，芬太尼具有更大的作用效果和安全范围）。静脉注射 1min 即起效，4min 达高峰，维持 30min60min；肌内注射时约 7min8min 发生镇痛作用，可维持 1h2h。肌内注射生物利用度 67%，蛋白结合率 80%，消除 T1/2约 3.7h。芬太尼吸收后在肝脏快速代谢，其主要代谢途径为 N-去烷基、水解去丙酰基及苯基、哌啶环和支链的羟化反应，其中主要为 N-去烷基芬太尼和去丙酰基芬太尼。芬太尼大部分以代谢产物的形式经尿和粪便排泄，约 75的芬太尼主要以代谢产物的形式排泄入尿，原形药物少于 10；约 9的使用量以代谢产物的形式排泄入粪便。血浆中未结合的芬太尼平均值估计为 1321，代谢产物与约 10的原形药由肾脏排出。_