DB23∕T 3039-2021 灵芝液体菌种制备技术规程(黑龙江省).pdf

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1、DB23黑龙江省地方标准2021-12-24 发布2022-01-23 实施DB23/T 30392021黑龙江省市场监督管理局发 布灵芝液体菌种制备技术规程ICS 65.020.01CCS B 05DB23/T 30392021I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省林业和草原局提出。本文件起草单位：尚志市远成菌业有限公司、东北林业大学、哈尔滨学院、黑龙江省尚志国有林场管理局老街基林场、黑龙江省尚志国有林场管理局、黑龙江省林业和草原局调查规划

2、设计院。本文件主要起草人：邹莉、许泽成、孙婷婷、韩金胜、蔡晓楼、王旭彤、耿楠楠、孙健、刘传龙、曲晓磊、李亚伟、乌木提巴合提别克、佟鑫宇。DB23/T 303920211灵芝液体菌种制备技术规程1范围本文件规定了灵芝（Ganoderma lucidum）液体菌种制备的环境卫生要求、生产仪器和设备、菌种选择、制备母种、制备摇瓶液体种、液体种发酵罐空消、制备发酵罐液体种培养基、发酵罐液体种的接种、发酵罐液体种培养条件、发酵罐液体种检测、发酵罐液体种质量要求、生产档案。本文件适用于灵芝液体菌种制备。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

3、仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 150.1压力容器第 1 部分：通用要求GB/T 1921工业蒸汽锅炉参数系列GB 5749生活饮用水卫生标准GB/T 11165实验室 pH 计GB/T 13554高效空气过滤器GB 19153容积式空气压缩机能效限定值及能效等级GB 50073洁净厂房设计规范NY/T 528食用菌菌种生产技术规程3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4环境卫生要求4.1生产环境应符合 NY/T 528 的规定。4.2生产车间应符合 GB 50073 的规定。5生产仪器和设备液体种发酵罐应符合 G

4、B/T 150.1 的规定，空气压缩机应符合 GB 19153 的规定，空气过滤器应符合GB/T 13554 的规定，pH 计应符合 GB/T 11165 的规定，蒸汽锅炉应符合 GB/T 1921 的规定，高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、液体菌种接种枪、冰箱、显微镜、磅秤、天平应符合 NY/T 528 的规定。DB23/T 3039202126菌种选择选择抗逆性强、抗杂菌能力强、菌丝生长健壮、产量高的菌种。7制备母种7.1母种培养基的制作制作马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）或综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA），装入试管（18mm 180 mm 或 20 mm 20

5、0 mm）中，分装量宜为试管长度的 1/4，塞上棉塞，棉塞应使用梳棉。将试管放入高压蒸汽灭菌锅中，在 0.105 Mpa0.125 Mpa 下灭菌 30 min。灭菌后摆放成的斜面培养基顶端应距棉塞底部20 mm。7.2接种与培养在无菌条件下，用接种钩取黄豆粒大小的初始菌种接种在母种培养基上。母种培养的温度宜为281，空气相对湿度控制在40%50%，通风、避光培养14 d18 d。8制备摇瓶液体种8.1培养基配方培养基配方：葡萄糖 20 g、玉米粉 10 g、酵母粉 5 g、蛋白胨 3 g、磷酸二氢钾 2 g、硫酸镁 1 g、水 1000 mL。水的质量应符合 GB 5749 的规定。8.2培

6、养基的制作、灭菌将配方中的原料充分混合均匀，装入 500 mL 或 1000 mL、耐 126高温、无色或近无色的玻璃三角瓶中，装液量宜为三角瓶体积的 1/4，用 16 cm 16 cm 聚乙烯透气封瓶膜封口。在 0.105 Mpa0.125Mpa 下灭菌 30 min。8.3摇瓶液体种的制备在无菌条件下，用接种铲将一管母种接入摇瓶液体种培养基中，置于恒温振荡培养箱，在 28以180 r/min 振荡培养 9 d12 d。当培养液澄清透明，菌丝球密集均匀悬浮于液体中不分层，即可获得摇瓶液体种。9液体种发酵罐空消液体种发酵罐初次使用，应检查发酵罐上全部阀门和压力表，进行空消。空消时罐内蒸汽压力应

7、达到 0.105 Mpa0.125 Mpa、温度应达到 121124灭菌 40 min。10制备发酵罐液体种培养基10.1培养基配方在8.1配方的基础上加入2.9 mL/L的消泡油。10.2初始 pH 值1 mol/L HCl 或 1 mol/L NaOH 调节 pH 值为 5.56.0。DB23/T 30392021310.3投料与定容将 10.1 中的原料按比例充分混合均匀，倒入液体种发酵罐中，加水定容至罐体总容积的 65%70%，拧紧上料口盖。10.4灭菌液体种发酵罐内蒸汽压力应达到 0.105 Mpa0.125 Mpa，温度应达到 121124灭菌 40 min。10.5冷却灭菌后将冷

8、水通入发酵罐夹层或者内置冷却系统中循环，使培养基降温至 2428。降温过程中应及时向发酵罐内通入无菌风。11发酵罐液体种的接种用带有手柄的内径略大于接种口的铁丝圈缠绕纱布，蘸上 95%的酒精，套在接种口上点燃。打开摇瓶液体种封瓶膜，用火焰灼烧瓶口 30 s40 s，打开接种口盖，将摇瓶液体种迅速倒入罐中，接种量为发酵罐装液量体积的 8%。迅速盖好接种口，拧紧。12发酵罐液体种培养条件12.1通风量每分钟宜通入无菌空气 1.25 m3。12.2罐压应保持在 0.03 Mpa0.05 Mpa。12.3培养温度宜控制在 281。12.4培养时间宜控制在 8 d10 d。13发酵罐液体种检测13.1取

9、样接种 4 d 后进行检测，用酒精火焰灼烧取样阀 30 s40 s，弃掉最初流出的少量液体种，取 30 mL50 mL 液体种放入无菌 150 mL 三角瓶中，塞紧棉塞。取样后应用酒精火焰把取样阀烧干。13.2检测对 13.1 所取样品在 PDA 平板培养基上画线培养，在 281下培养 2 d3 d，每天观察菌落生长情况，若 PDA 平板培养基上灵芝菌丝正常生长，没有杂菌污染，则表明菌种合格。14发酵罐液体种质量要求14.1感官指标应符合表 1 的要求。DB23/T 303920214表 1 感官指标项目指标菌液色泽球状菌丝体呈乳白色，滤液呈黄棕色菌液形态菌液稍粘稠，有大量球状菌丝体悬浮、分布均匀、不迅速分层菌液气味有灵芝菌种培养时特有的香味，无异味，发酵罐排气口气味正常14.2理化指标应符合表 2 的要求。表 2 理化指标项目指标pH 值3.55.5菌丝湿重（g100 mL）5显微镜下菌丝形态菌丝粗壮，有球状和丛状菌丝，分布均匀样品无菌检查有灵芝菌丝生长，无霉菌、酵母菌、细菌菌落生长15生产档案应建立生产档案，内容包括：环境卫生要求、生产仪器和设备、菌种选择、制备母种、制备摇瓶液体种、液体种发酵罐空消、制备发酵罐液体种培养基、发酵罐液体种的接种、发酵罐液体种培养条件、发酵罐液体种检测、发酵罐液体种质量要求。_