NY∕T 3152.5-2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第5部分：溞类毒性试验(农业).pdf

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1、ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3152.5一2017微生物农药环境风险评价试验准则第5部分:渥类毒性试验Risk assessment test guidelines for microbial pesticide-Part 5:Daphnia toxicity test 2017-12-22发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T 3152.5-2017 目UNY/T 3152(微生物农药环境风险评价试验准则分为6个部分:一一第1部分:鸟类毒性试验;一一第2部分:蜜蜂毒性试验;一一第3部分:家蚕毒性试验;一一第4部分:鱼类毒性试

2、验;一一第5部分:滔类毒性试验;一一第6部分:藻类生长影响试验。本部分为NY/T3152的第5部分。本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业部种植业司提出并归口.本部分起草单位:农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:谭丽超、周艳明、卡元卿、续卫利、姜辉、陈朗、田丰。I 1 范围微生物农药环境风险评价试验准则第5部分:渣类毒性试验NY/T 3152.5-2017 本部分规定了微生要求。、质量控制、试验报告等的基本本部分适用3 3.1 3.4 细菌芽抱、真菌抱显微镜下一

3、个完整的1完整的实体。3.5 细菌营养体vegetative bacterium 单个活的生物体，通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.6 原生生物protozoa 原生生物门各个成员的一个完整的营养体、抱子或抱囊。3.7 病毒virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。or proto哩。皿cyst成单个CFU的一个NY/T 3152.5-2017 3.8 最大危害暴露量maximum hazard e邓osurelevel 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露量，通常以预测暴露量与安全系数的乘积来表示。3.9 毒性toxicity 微生物和/或毒素引

4、起受试生物中毒或病变的能力。其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复制和生命活动。3.10 半数抑制量median effective dose or concentration,ED，四/ECs。在规定时间内，通过指定感染途径，引起50%受试生物活动受抑制时所需最小微生物数量或毒素量。3.11 活动抑制immobilisation 轻晃试验容器，涵在15s内不能游动视为活动抑制，但允许附肢微弱活动。4 试验概述在一定试验条件下，以-定的供试物浓度或剂量测试对受试渣的活动受抑制情况。当供试物最大危害暴露量出现对受试生物50%及以上具有活动抑制时，则还需进行剂量效应试验和活动抑制验证试验。活动抑

5、制以EDso/ECso表征。5 试验方法5.1 材料和条件5.1.1 供试生物推荐使用大型法CDaphniamagna Straus)，保持良好的培养条件，使大型渣的繁殖处于孤雌生殖状态。选用实验室条件下培养3代以上、出生24h内的非头胎渣。受试渥应来源于同一母系的健康渣，未表现任何受胁迫现象(如死亡率高、出现雄渣和冬卵、头胎延迟、体色异常等)。5.1.2 供试物5.1.2.1 类型微生物母药、制剂产品等。5.1.2.2 批次通常情况下，试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时，应在试验报告中记录供试物的批次。5.1.2.3 计数方法计数方法如下:一一细菌可采用稀释平板菌

6、落计数法、荧光定量PCR等测定;-一真菌抱子以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法或血球计数板法等测定;一一原生动物以个体数目为计数单位，可采用血球计数板法等测定;一一病毒以包涵体等感染单位为计数单位，可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定;一一-其他单位，根据微生物的类型和特性选择最适当的计数方法。以上推荐计数方法，参见附录A、附录B、附录C.5.1.3 主要仪器设备超净工作台。2 灭菌锅。显微镜。解剖镜。分光光度计。聚合酶链式反应仪。水质测定仪。温湿度计。玻璃器皿。天平等。5.1.4 试验条件滋类的培养、IS0标准稀释水、稳定，满足pH在6.250 mg/L;1 000 lx 1

7、500 garis)以提供每下，5.2 5.2.1 常，则要延长暴露时间，5.2.6 最大危害暴露NY/T 3152.5-2017 的规定。重组水推荐使用试验期间水质应保持计在140mg/L h:8 h，光照强度(Chlorella vul-)等。喂食量应长条件5只受试搔。现活动抑制或明显异水体接触暴露途径，供试物最霄瞌顺捡，嘿供试微生物农药推荐施用量在15 cm 7.)(体中浓度的1000倍设计最大危苦事霄砸喔-明苦均能达到时，以较高浓度作为最大危害暴露量。当因制剂剂型、水质等条件限制，供试物溶液浓度不能达到最大危害暴露量时，则采用供试物在水中能配置得到的最大量进行试验。试验开始后，每日观察

8、并记录受试溃的活动受抑制数和异常症状。当受试涵在试验期间未发生活动抑制，则无需进行剂量效应试验和活动抑制验证试验;当受试法在试验期间出现50%及以上的活动抑制，则需进行剂量效应试验和活动抑制验证试验。5.2.7 剂量效应试验根据最大危害暴露量试验结果，按一定比例间距设置5组7组供试物系列浓度，将受试滔暴露于不同浓度的供试物下，试验开始后，每日观察并记录受试涯的活动受抑制数及异常症状，求出试验结束时供试物对滋类的ECso值及其95%置信限。3 NY/T 3152.5-2017 5.2.8 活动抑制验证试验将用无菌水清洗后的受试渥进行组织破碎，然后用无菌水冲洗破碎组织，取适量清洗液接种至选择培养基

9、，将培养物置于适宜生长条件下培养，分离纯化疑似菌株，疑似菌株经形态学、生理生化及核酸等方法鉴定并确认为目标菌株后，再以相同暴露途径感染健康的受试渣。如果受试溢出现活动抑制，则证实目标菌株对法类具有活动抑制能力。5.3 数据处理5.3.1 统计方法选择试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3中所述的统计学方法，也可根据试验情况选择其他合适的统计方法。5.3.2 差异显著性检验5.3.2.1 概述差异显著性检验推荐采用独立样本t检验或单因子方差分析COne-WayANOVA,LSD检验)等。显著水平取0.05(差异显著、户S，-圣J.(2)式中:t.叫一一在F检验中误差自由度下，显著水平为的

10、临界t值;SX;-I，-一-均数差异标准误，按式(3)计算。式中:MS.一-F检验中误差均方;n一各处理重复数。S-%j./2丽./n.5.3.3 半数抑制量计算渣类半数抑制量EDso/ECso的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算，也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。具体计算方法见GB/T31270.13.6 试验报告4 试验报告应包括下列内容:一一试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号;一一试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况;一-试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期;试验摘要;NY/T 3152.5-2017 一一供试物基本信

11、息(例如，含量和组成信息，以及任何改变供试物生物活性物质的含量和组成信息，施用量、施用方法等);一一受试生物的名称、来源、大小及饲养情况等;一一试验条件，包括试验温度、光照、氧含量、pH等;试验系统的详细描述;一一试验结果。5-NY/T 3152.5-2017 附录A(资料性附录)稀释平板菌落计数法11A.1 方法原理将供试物经无菌水分散处理后，在固体培养基上由单个细胞生长并繁殖成一个菌落，因而可以根据形成的菌落数来计算供试物中微生物的数量，A.2 试剂蛋白陈。牛肉膏。氯化销(NaCI)。氢氧化纳溶液:1 mol/L。盐酸溶液:1 mol/L。葡萄糖。磷酸二氢饵(KH2PO，)。硫酸簇(MgS

12、O，)。琼脂。孟加拉红。蒸馆水。氯霉素。A.3 仪器设备高压蒸汽灭菌锅。恒温培养箱。超净工作台。酸度计等。A.4 固体培养基平饭的制备A.4.1 细菌培养基平饭依次称取蛋白陈10g、牛肉浸膏3g、氯化纳5g、琼脂15g18 g，溶于900mL蒸馆水中，置于电炉上加热，搅拌至完全溶解，加蒸饱水至1000mL.以1mol/L氢氧化纳溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07.2.分装于500mL三角瓶中，每瓶装150mL，塞上棉塞，经121.C高压蒸汽灭菌20min,培养基温度降至约50.C后倒入无菌培养皿中，每板约15mL.A.4.2 真菌培养基平板依次称取蛋白陈5g、葡萄糖10g、磷酸二氢饵

13、19、硫殴簇0.5g、琼脂15g18 g、孟加拉红0.03g、氯霉素0.1g，溶于900mL蒸馆水中，置于电炉上加热，搅拌至完全溶解，加蒸馆水至1000mL.分装于1)本方法适用于细菌、真前袍子等计数.但细菌、真菌袍子等计数不仅限于本方法.6 NY/T 3152号-2017500mL三角瓶中，每瓶装150mL.塞上棉塞，经121C高压蒸汽灭菌20min.培养基温度降至约50C后倒入无菌培-养皿中，每板约15mL。A.5 样品的处理称取-定量的供试物，加入盛有适当元菌水的三角瓶中，通过振荡、超声等方法使供试物充分分散成单细胞，形成菌悬液，然后用容量瓶和无菌水定容，配置一定浓度的微生物悬浮母液备用

14、。上述过程均应无菌操作。A.6 样晶母液的稀释涂布用无菌刻度吸管吸取1mL上述配制好的微生物悬浮母液ilJ9 mL元菌水中，按10倍法依次稀释，细菌通常稀释到10-8并选择1081O-6稀释菌悬液用于平板涂布;真茵通常稀释到10-7.并选择1O-71O-5稀释菌悬液用于平板涂布。吸取100L稀释液置于培养基平板表面，立即用无菌玻璃涂棒或接种针均匀涂抹于培养基表面，将涂布后的平板倒置于温度适宜的培养箱中黑暗培养。当用同一支吸管接种同一样品不同稀释浓度时，应从高稀释度(即低浓度菌悬液开始，依次向较低稀释度的菌悬液顺序操作。A.7 菌落计数细菌培养基平板培养2d3 d后取出，选择细茵茵落数量2020

15、0之间的培养皿进行计数。真菌培养基平板培养3d5 d后取出，选择真茵茵落数量10100之间的培养皿进行计数。母液微生物浓度或含量按式(A.1)计算。C=NXX(A.1)式中:C一一母液微生物浓度或含量，单位为菌落形成单位每克(CFU/g)或菌落形成单位每毫升(CFU/mL);N 培养基平板微生物菌落平均数，单位为个;X一一母液稀释倍数。7 NY/T 3152.5-2017 B.1 方法原理B.5 计数时若计数格(Rp80小格)的微生上微生物的统计应有统一数右线，以减少误差。即位于本格上定计入相应的格中。样品浓度或含量按式(8.1)计算。附录B(资料性附录)血球计数饭法1)确定面积和容积的载玻片

16、上(血球，用滴管吸取充满。在显微镜下进、右下、右上、中间的5个中方一样品至少计数2次，对沉降在格线，计数时则数上线不数下线，数左线不入本格，本格的下线和右线上的微生物按规C=N X 25/5 X 10 X 103 X X.(8.1)8 式中:C一一-样品浓度或含量，单位为个每毫升(个/mL);1)本方法适用于体型较大的微生物，如真菌袍子、酵母、多角体病毒和原生动物等计数.但真商抱子、酵母、多角体病毒和原生动物等计数不仅限于本方法.N一-5个中方格的微生物总数;X一-样品稀释倍数。NY!T 3152.5-2017 9 NY/T 3152.5-2017 C.1 方法原理附录C(资料性附录)荧光定量

17、P法1)SYBR Green能结正相关。因此，其荧光信号强度与dsDNA的数量阜:画，C.4 C.4.1 累积曲线，最后通过引物面.向何.岳芝哩醺噩噩噩噩盹神-原则设计引物，使引物Tm值为6样品基因说明提取样品基特异基因片段8、.且提取何喃噩矗因组喔圈圈匾嚣囔板，P黯特异基因片段，采用两步法扩增，PCR扩增体系如下:南.隘25O!aq酶而陋，dNTP2L(20 rnmo1/L),sl物1(Pl)、引物2(P2)各lL，慧国国曲函M1I!IIr25L反应条件为:94C预变性5min;(94C变性，30s;60C退火延伸30s)3()!佣可寸u允分延伸10min4C保存。电泳检测:PCR产物使用1

18、%琼脂糖凝胶电泳检测，确保无非特异性扩增并回收扩增片段。TA克隆:按照TA克隆标准步骤将回收后的扩增产物连接至pMD18T载体并转化至大肠杆菌DH5a感受态中;LB抗性平板(Amp100)结合蓝白斑筛选，挑取单克隆转移至液体LB(Amp100)中，37C摇床培养12h，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒并送至测序公司进行测序验证，确定目的基因片段与载体相连且序列正确。C.4.2 标准晶模板的拷贝数确定1)本方法适用于细菌、真商和l病毒等tt数.但细菌、真菌和病毒等计数不仅限于本方法.10 NY/T 3152.5-2017 使用Nanodrop或其他仪器测定含目的基因片段的载体浓度，按式Cc.1)

19、计算目的基因拷贝数CCopies/L)。Q=6.02X 1023 XCX 10-9/L X660Cc.1)式中zQ二一基因拷贝数，单位为拷贝数每微升CCopies/L);C-DNA浓度，单位为纳克每微升Cng/L);L二-DNA长度，单位为碱基对Cbp)。将含目的基因片段的载体用ddH20进行10倍梯度稀释，稀释为10Copies/L 10 Copies/L，此即为标准品模板，一20C保存样品。C.5 标准曲线绘制与扩增效率计算标准品模板的qPCR扩增:采用20LqPCR反应体系，两步法进行扩增，具体为:标准品模板2L，SYBR Green Supermix 10 L，引物1和引物2各1L，加

20、无菌双蒸水补足体积至20L;反应条件为:95C预变性5min;C95C变性，10s;60C退火延伸，30s)40个循环;溶解曲线采集程序以程序默认为准;其中，每个稀释度的样品做5个重复，阴性对照使用无模板的元菌双蒸水。标准曲线的绘制:确定溶解曲线为单峰，且峰值温度在80C90C，确定溶解曲线峰值;并确定扩增生成Ct值在15-35区域间，同一个样品不同重复间的Ct值差异小于O.趴在满足此条件的情况下，以标准品模板的拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线，并求出标准曲线线性方程。扩增效率CE)计算:E的范围应为90%-110%，保证qPCR每完成一个循环，底物浓度扩增一倍;E按式Cc.2)计

21、算。E=ClO一川一1)X100.Cc.2)式中:E一一扩增效率，单位为百分率C%);h一一标准曲线斜率。C.6 样晶微生物的定量C.6.1 样品总基因组DNA的提取根据基因组提取试剂盒说明书提取样品基因组总DNA。C.6.2 样晶微生物计数以提取的样品基因组总DNA为模板，进行qPCR反应。qPCR反应条件与C.5一致，根据反应生成的Ct值和已建立的标准曲线，计算各目的基因片段的拷贝数，从而评估样品中待测物种的丰度。11 NY/T 3152.5-2017 附录D资料性附录)合格试验用水的部分化学特性合格试验用水的部分化学特性参见表D.l。12 E.1 标准稀释水配置附录E(资料性附录)重组水

22、的配置表E.l给出了ISO标准稀释水的配置方法。表E.1 ISO标准稀释水储备液(单一物质物质浓度.mg/LCaCI,2H,O 11 760 MgSO.7H,O 4930 NaHC,2590 KCI 230 注:配置用水为纯水，如去离子水、蒸馈水或反向渗透水，其电导率10S/cmoE.2 Elendt M4和ElendtM7培养基配制NY/T 3152.5-2017 每升lSO标准稀释水中储备液的加入盘.mL25 25 25 25 用超纯水分别配制储备液I、储备液E和混合维生素储备液，制备Elendt培养基时，用储备液I(含所有微量元素的混合液)制备储备液II.在使用前最后加入混合维生素储备液

23、，见表E.2-表E.6.表E.2储备液I的制备(单-物质)组分名称水中加入盘.mg/L组分名称水中加入量.mg/LH斗殴)，57190 ZnCI,260 MnCI,4H,O 7210 co二1，6H,O 200 LiCI.H,O 6120 KI 65 RbCI 1420 Na,SeO,43.8 SrCI,6H,O 3040 NH.Vo,11.5 NaBr 320 Na,EDTA.2H,O 5000 Na,MoO.2H,O 1 260 FeSO.7H,O 1 991 CuCI,2H,O 335 2 L Fe-EDTA溶液 Fe-EDTA溶液:将Na，EDTA和FeSO单独配制，混合在一起后立即灭

24、菌.表E.3储备液E的制备(单一物质)将储备液I加入到水中的盘.mL/L组分名称M4 M7 H,BO.1.0。.25MnCI,4H,O 1.0 O.25 LiCI 1.0 O.25 RbCI 1.0。.2 5SrCI,6H,O 1.0 O.25 NaBr 1.0 0.25 Na,MoO.2H,O 1.0。.2513 NY/T 3152.5-2017 表E.3(续)将储备液I加入到j水中的盘，mL/L组分名称M4 M7 CuCl,.2H,O 1.0 0.25 ZnCl,1.0 1.0 CoCl,6H,O 1.0 1.0 KI 1.0 1.0 Na,SeO.1.0 1.0 N比V1.0 1.0 F

25、e-EDTA溶液20.0 5.0 表E.4常量营养储备液的制备(单一物质)组分名称水中加入量，mg/L总体积，mLCaCl,.2H,O 293800 1000 Mg仪).7H,O 246600 1000 KCl 58000 1000 NaHC,64800 1000 Na,Sio,.9比050000 1000 NaNo,2740 1000 KH,PO 1430 1000 K,HPO.1840 1000 表E.5 Elendt M4和ElendtM7的制备11U入储备液的最(mL/L)组分名称M4 M7 储备液I!(微量兀萦混合液)50 50 CaCl,.2H,O 1.0 1.0 MgSO.7H,

26、O O.5 O.5 KCl O.1 O.1 常量营养储备液NaHCo,1.0 1.0(单-物质)Na,Sio,.9H,O。.2O.2 NaN。lO.1 KH,PO.O.1 O.1 K,HPO。lO.1 混合维生索储备液O.1 O.1 表E.6混合维生素储备液的制备a组分名称水中i1U入量(mg/L)总体积b，mL盐酸硫胶维生素B，)750 氯钻胶(维生素E与10 1000 钙长石维生素H)7.5 混合维生素储备液以5mL分装后冷藏.3种维生素组分加入水中并标定ilJ1000 mL.14-参考文献1C;B 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定.2NY/T 2743-

27、2015 甘舷白色条纹病菌检验检疫技术规程实时荧光定量PCR法.3SN/T 2358-2009 国绕口岸炭瘟芽抱杆菌荧光定量PCR检测方法.NY/T 3152.5-2017 15 EON-PNmF的同hz中华人民共和国农业行业标准微生物农药环境风险评价试验准则第5部分:蚤类毒性试验/1l 3152.5-2017 晤中国农业出版社出版(北京市朝阳区麦子店街18号楼)(邮政编码100125网址www.c臼)北京印刷一厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销9导非晤开本880mmX1230mm 1/16 印张1.25 字数25千字2018年5月第1版2018年5月北京第1次印刷书号16109 4426 定价30.00元晤峰版权专有侵权必究举报电话(010)65005894